4 mM L-谷氨酰胺增强 CTS OpTmizer One SFM 在 CAR T 细胞制备中的表现

引言

CAR T 细胞疗法已成为治疗难治复发性血液肿瘤的重要手段，而制备高质量、足量的 CAR T 细胞高度依赖于可控、稳健的体外培养体系。CTS OpTmizer One SFM 是一款无血清、动物源成分–free（AOF）的 T 细胞培养基，专为细胞治疗研发和生产设计，可在满足 CGMP 原则的前提下，为 T 细胞的生长、扩增和功能维持提供优化环境。

 

在 CAR T 细胞工艺中，谷氨酰胺是 T 细胞增殖和代谢的关键营养物质。常用的 L-谷氨酰胺存在易降解、稳定性有限等问题，因此业界也广泛采用更稳定的谷氨酰胺二肽制剂 GlutaMAX Supplement。然而，在生物制剂生产环境中，培养基不仅需要具备化学稳定性，还必须兼顾营养物质的生物利用度。

 

本研究系统比较了在 CTS OpTmizer One SFM 中补加不同浓度 GlutaMAX Supplement 与 4 mM L-谷氨酰胺，对 T 细胞扩增、CD19 CAR 转导效率以及表型的影响，并进一步评估在不同起始细胞密度下的 PBMC 扩增表现，为细胞治疗工艺开发提供补料选择依据。

应用背景：CAR T 工艺中谷氨酰胺来源的考量

在 T 细胞培养早期阶段，谷氨酰胺既是能量和碳源，也是蛋白质合成的关键氨基酸。

  • L-谷氨酰胺：生物利用度高，但在水溶液中易自发降解，可能影响长期培养或高温储存条件下的稳定性。
  • GlutaMAX Supplement（谷氨酰胺二肽）：更稳定，不易降解，但需要细胞或酶解过程释放游离谷氨酰胺，其利用速度可能与 L-谷氨酰胺不同。

对于 CAR T 细胞制备来说，工艺需在培养基稳定性与细胞对营养物即时需求之间取得平衡。本研究聚焦在 CTS OpTmizer One SFM 中，评估 L-谷氨酰胺与 GlutaMAX Supplement 的适配性与工艺弹性。

实验设计与方法（重组以优化结构）

细胞来源与分选

  • 起始材料：来自健康供者的 leukopak（2 位供者，用于主扩增与转导实验；2 位供者用于 PBMC 扩增实验）。
  • 分选工具：
    • CTS Detachable Dynabeads CD4 与 CD8（4:1 磁珠:细胞），
    • CTS DynaCellect Magnetic Separation System 完成磁分选与洗脱。
  • 去除磁珠：使用 CTS Detachable Dynabeads Release Buffer 于 CTS DynaCellect 系统中释放并收集 T 细胞。

 

培养基与补料条件

所有实验均在 CTS OpTmizer One SFM 中进行，比较的补料条件包括：

  • L-谷氨酰胺：4 mM
  • GlutaMAX Supplement：2 mM、4 mM、6 mM（T 细胞扩增 + 转导实验）；
  • PBMC 扩增实验中比较：4 mM L-谷氨酰胺 vs 4 mM GlutaMAX Supplement。

额外细胞因子补料：

  • 20 U/mL 人 IL-7
  • 100 U/mL 人 IL-15（T 细胞扩增 + 转导实验）
  • PBMC 实验中，使用 100 IU IL-2 激活，后续在第 3 天添加 IL-2 维持。

 

激活与转导方案

T 细胞激活

  • 起始密度：1.0 × 10⁶ T 细胞/mL，于 G-Rex 24 孔板中接种。
  • 激活方式：
    • CTS Detachable Dynabeads CD3/CD28，3:1 磁珠:细胞；
    • 一种可溶性 CD3/CD28 激活剂（按厂家说明）。

CD19 CAR 转导

  • 激活后 24 h（第 1 天）进行转导；
  • 使用 CD19-CAR 慢病毒，MOI=5。

 

扩增与培养条件

  • 第 3 天补加 CTS OpTmizer One SFM（含 IL-7/IL-15），补足体积至 8 mL。
  • 第 6 与第 8 天进行约 60% 体积的换液。
  • 培养条件：37°C，5% CO₂，培养至第 10 天。

 

PBMC 扩增实验

  • 起始细胞：PBMC（2 位供者）。
  • 起始密度：
    • 0.5 × 10⁶ T 细胞/mL
    • 1.0 × 10⁶ T 细胞/mL
  • 激活：CTS Dynabeads CD3/CD28，3:1 磁珠:细胞 + 100 IU IL-2。
  • 扩增：持续至第 10 天，第 5、7 天进行约 50–60% 换液，并补加 IL-2。

 

评估指标

  • 折算扩增倍数与总细胞数（Vi-CELL / Vi-CELL BLU 细胞计数仪）；
  • 细胞活率；
  • CD19 CAR 表达比例（转导效率）；
  • 早期记忆表型：CCR7⁺/CD45RA⁺、CD27⁺/CD62L⁺（Attune NxT 流式细胞仪检测）。

结果与讨论

1. L-谷氨酰胺在不同激活条件下支持更高 T 细胞扩增

在补加不同谷氨酰胺来源的条件下，比较了 Detachable Dynabeads CD3/CD28 与可溶性激活剂的 T 细胞扩增表现。

  • 第 6 天：
    • 在可溶性 CD3/CD28 激活条件下，4 mM L-谷氨酰胺实现了最高平均约 16 倍扩增；
    • Detachable Dynabeads CD3/CD28 激活下，不同补料条件下的扩增均超过 20 倍，其中 4 mM L-谷氨酰胺表现与 4 mM、6 mM GlutaMAX Supplement 相当；
    • 2 mM GlutaMAX Supplement 在两种激活方式下扩增倍数最低。
  • 第 10 天：
    • 可溶性激活器：4 mM L-谷氨酰胺与 6 mM GlutaMAX Supplement 均能支持 ≥40 倍的扩增，其中 L-谷氨酰胺整体略优；
    • Detachable Dynabeads CD3/CD28 激活下，各 GlutaMAX 浓度与 4 mM L-谷氨酰胺之间扩增表现相近，说明该激活方式本身具有较强的扩增驱动能力。

总体而言，在大多数测试条件中，4 mM L-谷氨酰胺在 CTS OpTmizer One SFM 中更稳定地促进了 T 细胞扩增。

2. CD19 CAR 转导效率主要受激活方式影响

在上述扩增体系中，于第 1 天使用 CD19-CAR 慢病毒进行转导，比较不同补料对转导效率的影响。

  • 在 4 mM L-谷氨酰胺或 2/4/6 mM GlutaMAX Supplement 条件下，平均 CAR 阳性 T 细胞比例相近；
  • Detachable Dynabeads CD3/CD28 激活条件下，平均转导效率 >85%；
  • 可溶性 CD3/CD28 激活条件下，平均转导效率约 65%，显著低于前者。

说明在本研究设置中，激活方式对转导效率的影响大于谷氨酰胺来源：

  • 使用 Detachable Dynabeads CD3/CD28 激活时，无论补加 L-谷氨酰胺还是 GlutaMAX Supplement，均可获得较高且一致的转导效率。

3. 补料方式对 CAR T 早期记忆表型影响有限

在第 10 天，对扩增后的 CAR T 细胞进行表型分析：

  • CCR7⁺/CD45RA⁺ 早期记忆亚群在 4 mM L-谷氨酰胺与 4 mM、6 mM GlutaMAX Supplement 条件下比例相近；
  • CD27⁺/CD62L⁺ 细胞比例在不同补料条件下总体相当，但 4 mM L-谷氨酰胺平均值略高，且 GlutaMAX Supplement 条件下供者间差异略大。

整体结果表明，在 CTS OpTmizer One SFM 中补加 L-谷氨酰胺或 GlutaMAX Supplement 均能维持 CAR T 细胞的早期记忆表型，补料选择对表型影响相对较小。

4. 低起始密度 PBMC 扩增中 L-谷氨酰胺优势更加明显

为模拟工艺开发中常见的不同接种密度场景，研究进一步比较在 PBMC 起始 T 细胞密度为 0.5 × 10⁶ 和 1 × 10⁶ cells/mL 时，4 mM L-谷氨酰胺与 4 mM GlutaMAX Supplement 的表现。

 

扩增倍数

  • 起始密度 0.5 × 10⁶ cells/mL：
    • 第 5 天和第 10 天，L-谷氨酰胺条件下的平均扩增倍数均显著高于 GlutaMAX Supplement；
  • · 起始密度 1 × 10⁶ cells/mL：
    • 第 5 天两种补料条件扩增相近；
    • 第 10 天总体扩增水平接近，仅呈轻微差异。

细胞活率

在 10 天培养过程中，L-谷氨酰胺和 GlutaMAX Supplement 条件下细胞活率均保持在较高水平：

  • 全程活率曲线基本重叠；
  • 到第 10 天，平均活率均 ≥84%。

说明两种补料都能在 CTS OpTmizer One SFM 中维持良好的 T 细胞存活，差异主要体现在扩增倍数和低起始密度适应性上。

典型应用场景（本节基于原文结果重组以优化结构）

结合上述实验结果，CTS OpTmizer One SFM 补加 4 mM L-谷氨酰胺可在以下场景中优先考虑：

 

1. CAR T 工艺初始开发与工艺摸索阶段

在尚未完全确定激活方式、接种密度或病毒转导参数时，需要培养体系具有较强的“容错性”和一致性：

  • 4 mM L-谷氨酰胺在不同激活方式、GlutaMAX 浓度和供者间表现出更稳定的扩增性能；
  • 有利于工艺早期快速筛选参数，减少因补料选择带来的变量。

2. 低起始细胞密度或受限样本量工艺

对于某些临床样本或特定适应症，起始 T 细胞数量有限：

  • 实验表明，在 0.5 × 10⁶ cells/mL 起始密度下，L-谷氨酰胺较 GlutaMAX Supplement 显著提升扩增倍数；
  • 可帮助在有限起始细胞量下获得足够的 CAR T 细胞剂量。

3. 追求高转导效率和统一表型的工艺

  • 搭配 CTS Detachable Dynabeads CD3/CD28 激活时，无论使用 L-谷氨酰胺还是 GlutaMAX Supplement，转导效率均可维持在较高水平；
  • 早期记忆表型（CCR7⁺/CD45RA⁺、CD27⁺/CD62L⁺）在两种补料条件下表现相近，为后续体内持久性和疗效提供潜在优势。

方案优势亮点

基于研究结果，CTS OpTmizer One SFM 补加 4 mM L-谷氨酰胺在细胞治疗工艺中的主要优势包括：

 

1. 扩增性能优越且更一致

  • 在多数条件下获得高于 GlutaMAX Supplement 的 T 细胞扩增倍数，尤其是在可溶性 CD3/CD28 激活或低起始密度 PBMC 条件下。

2. 兼顾高转导效率

  • 搭配 CTS Detachable Dynabeads CD3/CD28 激活，可实现 >85% 的平均 CD19 CAR 转导效率。

3. 维持细胞活率与表型稳定

  • 10 天培养后细胞活率 ≥84%；
  • 早期记忆表型在不同补料条件下均得以保持，工艺切换时更具稳定性。

4. 适用多种起始材料和工艺设定

  • 适用于从分选 T 细胞或 PBMC 起始的扩增流程；
  • 在不同激活方式和接种密度下均表现良好，有利于跨平台、跨项目应用。

5. 有利于工艺标准化与放大

  • 单一基础培养基 CTS OpTmizer One SFM 与统一 L-谷氨酰胺浓度，有利于建立标准化工艺和向临床生产放大。

小结

本研究系统比较了在 CTS OpTmizer One SFM 中补加 L-谷氨酰胺与 GlutaMAX Supplement 对 T 细胞扩增、转导效率和表型的影响，主要结论包括：

  • 4 mM L-谷氨酰胺是 CTS OpTmizer One SFM 的优选补料：在不同激活方式、起始材料和接种密度下，均表现出更高或相当的 T 细胞扩增能力。
  • 两种补料均能维持高活率和稳定表型：T 细胞活率和早期记忆表型在 L-谷氨酰胺与 GlutaMAX Supplement 条件下相近，说明补料选择对细胞质量影响有限。
  • 激活方式对转导效率影响更大：Detachable Dynabeads CD3/CD28 激活条件下的 CD19 CAR 转导效率高于可溶性激活剂，且这一趋势不受谷氨酰胺来源影响。
  • 工艺建议：在细胞治疗工艺开发中，推荐以 4 mM L-谷氨酰胺作为 CTS OpTmizer One SFM 的起始补料方案；如需使用 GlutaMAX Supplement，应在实施前充分验证其对具体工艺的支持能力。

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