RNAi 工具及递送技术基本知识问答

问题

可以点击您感兴趣的问题，快速找到答案。

• miRNA 和 siRNA 有什么区别?
• 如何使我们的 siRNA 实验标准化? 在 siRNA 实验中设置了多少个阴性对照?
• 我怎样确定我感兴趣的 siRNA 有敲低基因的作用？如何将其与 miRNA 效应区分开来？

答案

问：miRNA 和 siRNA 有什么区别?

答：RNA 干扰（RNAi）的过程可以通过小干扰 RNA（siRNA）或微 RNA（miRNA）来调节，但两者之间存在差异。siRNA 是哺乳动物细胞的外源性 RNA，它是一种双链 RNA，可以被细胞吸收或通过病毒等载体进入。miRNA 是内源性的（自然存在于细胞内）非编码 RNA，存在于较大 RNA 分子的内含子中，这些内含子经过几个步骤的加工才能产生成熟的 miRNA。典型的 siRNA 与其 mRNA 靶标具有完美的匹配，并在特征良好的复合物中间诱导分裂，导致 mRNA 水平降低或敲低。miRNA 通常通过与多个 mRNA 靶点的不完全碱基配对进行微调翻译（蛋白水平）；它们对 mRNA 水平的影响比 siRNA 更微妙，影响许多 mRNA。

要了解更多的力学观点，请参阅 Carthew 和 Sontheimer（2009）^[1]的综合评论。

问：如何使我们的 siRNA 实验标准化?

答：我们建议 RNAi 实验至少包括三种类型的对照：阳性对照、阴性对照和未经处理的对照。

• 阳性对照通常针对组成表达的管家基因，如 GAPDH，用于监测 siRNA 进入细胞的效率。
• 阴性对照的设计是非靶向性的，与已知基因的序列相似性很小，甚至没有序列相似性，用于区分非特异性效应和序列特异性沉默活性。
• 未经处理的对照组决定细胞存活率、表型和靶基因水平的基线水平。

为了使 siRNA 实验标准化，我们强烈建议使用阴性 siRNA 对照。与未经处理的对照相比，使用阴性对照的优势在于，它将细胞暴露于与转染试剂复合的 siRNA 中，这是建立基线效应的一个重要变量。为此，我们提供 Silencer™ Select Negative Control siRNAs，其设计目的是与小鼠、大鼠或人类基因没有显著的序列相似性，并通过微阵列分析评估其对基因表达的影响最小。

问：在 siRNA 实验中使用了多少个阴性对照？

答：我们的科学家建议 RNAi 实验至少有一个阴性对照。然而，在大屏幕中，研究人员通常使用多个阴性对照，特别是在显示高变异性的细胞检测中。在高通量筛选中使用多重阴性对照可以理解生物测定中的变异性和噪声，从而可以在铅的产生的下游分析中考虑到这一点。

参考文献

1. Carthew RW, Sontheimer EJ.(2009) Origins and Mechanisms of miRNAs and siRNAs.Cell 136(4):642–655.
2. Soutschek, J. et al.Therapeutic silencing of an endogenous gene by systemic administration of modified siRNAs.Nature 432, 173-178 (11 November 2004) | doi:10.1038/nature03121
3. Soutschek J et al.(2004) Therapeutic silencing of an endogenous gene by systemic administration of mocified siRNAs.Nature 432:173-178.