利用 E-Gel EX 琼脂糖凝胶优化 RNA 电泳变性与上样条件

引言

琼脂糖凝胶电泳是核酸分析中最经典、最常用的技术之一，可用于片段大小测定、样品质量评估以及回收纯化等环节。与 DNA 相比，RNA 更易形成稳定的二级结构并被 RNase 降解，因此在常规琼脂糖凝胶上获得准确、可重复的 RNA 分离结果更具挑战性。

 

传统 RNA 变性电泳通常需要在配胶和跑胶过程中加入甲醛等强变性试剂，不仅操作繁琐，还需要在通风橱内完成全部实验步骤，对实验者和实验环境都有更高要求。

 

Invitrogen™ E-Gel™ EX 预制琼脂糖凝胶与 E-Gel™ Power Snap/Power Snap Plus 电泳与成像一体化系统，将预制胶、高灵敏度染料和标准化电泳程序集成于一体，为 RNA 分析提供了更为简便、安全和快速的解决方案。本文基于 Thermo Fisher Scientific 的应用研究，对 E-Gel EX 琼脂糖凝胶在 RNA 分析中的变性条件和上样量进行了系统优化，并给出可直接用于实验室的推荐流程。

RNA 电泳应用背景

RNA 二级结构与变性需求

RNA 单链分子通过互补碱基配对极易形成复杂的二级结构（发夹、茎环等），这些结构会影响其在电场中的迁移速度，导致条带迁移异常或拖尾，影响片段大小判读。为获得可靠的片段大小信息，电泳前通常需要在变性条件下将 RNA 充分线性化。常见变性剂包括：

  • 甲醛
  • 尿素、硫氰酸胍等变性剂
  • 含汞化合物（如甲基汞氢氧化物）

然而，部分试剂毒性较强、配制复杂或需要特殊处理，不利于常规实验室推广使用。E-Gel EX 琼脂糖凝胶结合样品预处理中的甲酰胺和加热步骤，提供了一种无需在胶内引入有毒试剂的 RNA 变性和分离方案。

实验设计与方法

实验总体思路

本研究围绕以下三方面优化在 E-Gel EX 琼脂糖凝胶上的 RNA 电泳工作流程：

  1. 确定适用于不同 RNA 梯度的变性条件
  2. 评估样品和梯度在不同上样量下的分离效果
  3. 在多种 RNA 片段、总 RNA 及 poly(A)/非 poly(A) 样品中验证优化条件的适用性

试剂与仪器

  • E-Gel™ EX Agarose Gels, 1%（适用于 500–9,000 bases）
  • E-Gel™ EX Agarose Gels, 2%（适用于 100–1,000 bases）
  • E-Gel™ Power Snap Electrophoresis System
  • E-Gel™ Power Snap Plus Electrophoresis System
  • Invitrogen™ Millennium™ RNA Markers（500–9,000 bases）
  • Invitrogen™ Century™-Plus RNA Markers（100–1,000 bases）
  • Invitrogen™ RiboRuler™ High Range RNA Ladder
  • Invitrogen™ RiboRuler™ Low Range RNA Ladder
  • Universal Human Reference RNA（UHRR）及多种体外转录 RNA 片段和细胞/组织总 RNA
  • 甲酰胺（用于样品变性）

样品制备

  1. RNA 样品和标准梯度先用无核酸酶水稀释至目标浓度，总体积不超过 10 μL。
  2. 再加入 100% 甲酰胺或无核酸酶水，将总体积补至 20 μL（对应 E-Gel EX 凝胶单孔最大上样体积）。
  3. 视实验要求，将甲酰胺终浓度调至 50% 或保持为 0%。

RNA 变性条件

对以下组合进行比较：

  • 不处理（无甲酰胺、无加热）
  • 仅加 50% 甲酰胺（室温孵育）
  • 仅加热：70°C，5 分钟
  • 50% 甲酰胺 + 加热：70°C，5 分钟或 10 分钟

加热结束后样品立即置于冰上冷却，再上样电泳。

 

电泳与成像

  • 将 E-Gel EX 1% 或 2% 琼脂糖凝胶置于 E-Gel Power Snap 或 Power Snap Plus 系统中
  • 加样后静置 1 分钟，使样品充分扩散至孔底
  • 选择对应胶型的预设电泳程序运行
  • 使用系统内置相机成像，并通过 U 盘导出图像和条带分析结果

实验结果与讨论

一、RNA 变性条件优化

使用 Millennium RNA Markers（500–9,000 bases）和 Century-Plus RNA Markers（100–1,000 bases）分别在 1% 与 2% E-Gel EX 凝胶上，考察不同变性方式对条带清晰度和迁移行为的影响。

  • 仅加热：条带仍存在拖尾和分离不清现象，说明加热本身不足以完全破坏二级结构。
  • 仅 50% 甲酰胺：与对照相比，条带分离明显改善，迁移更规则；对 Millennium 梯度已能获得良好结果。
  • 50% 甲酰胺 + 加热：对 Century-Plus 梯度可进一步提升分辨率，条带更加细锐。

结论：

  • 在多数情况下，50% 甲酰胺处理即可显著改善条带分离；
  • 对部分梯度，**50% 甲酰胺结合加热（70°C）**可获得最佳分辨率，尤其适用于需要更高分辨率的片段分析。

二、梯度与样品的最佳上样量

梯度上样量窗口

通过在 0.5–4 µg 范围内调整梯度上样量，确定了在 E-Gel EX 凝胶上的推荐加载量：

  • Millennium RNA Markers：0.5 µg/孔 为最佳，条带均衡清晰；
  • Century-Plus RNA Markers：2 µg/孔 可获得最清晰的条带分辨。

样品 RNA 上样量（UHRR）

以通用人参考 RNA（Universal Human Reference RNA, UHRR）为模型，在 0.25–4 µg/孔范围评估不同上样量的迁移与条带形态：

  • 当上样量 ≥0.75 µg/孔时，出现明显拖尾及迁移减慢现象；
  • 0.25–0.5 µg/孔 范围内条带分离最佳、拖尾最少，适合作为常规总 RNA 上样范围。

三、不同片段大小 RNA 的变性与分辨

在实际 RNA 片段分析中，研究者采用一系列 eGFP 相关体外转录 RNA（868、1,017、2,716、4,525 bases）及配套梯度，对仅 50% 甲酰胺与“50% 甲酰胺 + 70°C 加热 10 分钟”两种条件进行比较（上样量约 100 ng/孔）。

  • 仅 50% 甲酰胺：条带偏淡，边界略显模糊；
  • 50% 甲酰胺 + 70°C 加热 10 分钟：样品和梯度的信号强度显著提升，条带轮廓更清晰，条带位置更加准确。

实用建议：

  • 对于多种片段长度混合的 RNA 样品，推荐 50% 甲酰胺 + 70°C 加热 10 分钟 的变性方案，以兼顾条带清晰度与信号强度。

四、RNA 梯度的“虚假条带”消除

在进一步实验中，将 RiboRuler High Range、RiboRuler Low Range、Century-Plus 和 Millennium 四种梯度分别在有无加热条件下进行比较（均在 50% 甲酰胺中处理）。

  • 对 RiboRuler High/Low Range 梯度而言，加热联合甲酰胺 后可有效消除电泳图像中的“虚假条带（phantom bands）”；
  • 对 Millennium 和 Century-Plus 梯度，加热与否对可见条带数目影响不大，但加热可进一步改善条带形态。

五、多类型 RNA 样品验证

最终，将优化出的变性和上样条件应用于更广泛的样品类型，包括：

  • 不同长度的 eGFP 体外转录 RNA（含 poly(A) 与非 poly(A) 形式）
  • 来自胎盘、HeLa 细胞、胸腺、Raji 细胞等来源的总 RNA
  • 不同长度的梯度混合使用

主要观察结果：

  • poly(A) 化 RNA 条带相对非 poly(A) 形式出现明显迁移位置变化，便于在同一胶上区分 poly(A)/非 poly(A) 样品；
  • 在优化上样范围内，纯化与未纯化样品之间的电泳表现差异不大，提示在某些场景下可略去额外纯化步骤，从而简化流程；
  • 部分总 RNA 及最长 9,000 bases 片段出现轻度拖尾，可能与样品中残留杂质或部分降解有关。

应用场景

在以下 RNA 相关实验中，利用 E-Gel EX 琼脂糖凝胶与优化后的变性及上样条件，可帮助研究者获得更稳定、可靠的结果：

  • 体外转录 RNA（IVT RNA）的长度和完整性验证
  • mRNA、lncRNA 等较长转录本的质量控制
  • 总 RNA 提取后 28S/18S 结构完整性评估
  • poly(A) 与非 poly(A) RNA 变体比较及工艺优化
  • 病毒 RNA、疫苗 RNA 或基因治疗载体 RNA 的片段分析

优势亮点


相较于传统自制变性琼脂糖凝胶，使用 E-Gel EX 琼脂糖凝胶并结合本文优化流程具有以下优势：
  1. 操作简化
    • 预制胶即开即用，无需配胶和缓冲液制备；
    • 变性步骤在样品管内完成，避免在胶中加入甲醛等有毒试剂。
  2. 变性条件温和但有效
    • 50% 甲酰胺即可满足大多数样品变性需求；
    • 必要时叠加 70°C 加热，可进一步提高条带锐度并消除梯度虚假条带。
  3. 上样窗口清晰
    • 梯度推荐上样量明确：Millennium 0.5 µg/孔，Century-Plus 2 µg/孔；
    • 总 RNA 推荐 0.25–0.5 µg/孔；
    • 综合研究结果，小片段 RNA（<1,000 bases）推荐 20–80 ng/孔，大片段 RNA（>1,000 bases）推荐 70–200 ng/孔，便于快速建立标准操作规程（SOP）。
  4. 系统集成与高通量潜力
    • E-Gel Power Snap/Power Snap Plus 提供统一的电泳与成像平台，一键运行预设程序；
    • 多种胶浓度和孔数规格可覆盖从小通量方法开发到中等通量样品检测的需求。

小结

本研究在 Invitrogen™ E-Gel™ EX 琼脂糖凝胶和 E-Gel™ Power Snap Plus 系统上，系统优化了 RNA 电泳所需的变性条件和上样量：

  • 50% 甲酰胺 是多数 RNA 样品获得良好分离的基础条件；
  • 50% 甲酰胺 + 70°C 加热 10 分钟 可进一步提高条带信号与分辨率，并消除部分梯度的虚假条带；
  • 梯度和样品的最佳上样量区间明确，为准确判断片段大小和样品质量提供了量化依据；
  • 在多种体外转录 RNA 和总 RNA 样品中验证了该流程的适用性，可为建立快速、可靠的 RNA 质量控制及片段分析方法提供参考。

研究数据表明，E-Gel EX 琼脂糖凝胶平台能够在简化操作的同时保持优异的分辨率和灵敏度，是 RNA 电泳分析的高效选择。

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