KingFisher PlasmidPro Maxi Processor 实现无离心大体积质粒 DNA 高效纯化

引言

质粒 DNA（plasmid DNA, pDNA）是分子生物学、细胞工程和基因治疗等领域的核心原材料。尤其在 mRNA 合成、疫苗开发、抗体与重组蛋白生产、细胞与基因治疗以及病毒载体生产中，大体积、高质量、低内毒素的质粒制备已成为流程放大和项目推进的关键环节。

 

传统的大量制备多采用柱式离心或真空过滤方式，操作步骤繁多，包括收菌、裂解、中和、澄清、柱平衡、结合、洗涤和洗脱等多个环节，不仅耗时耗力，还易成为实验室和早期工艺开发中的瓶颈。

 

Thermo Scientific™ KingFisher™ PlasmidPro Maxi Processor 通过一体化预装试剂卡匣和预设程序，将上述步骤自动化和封闭化，实现“倒入培养液，按下 Start 按键”的全自动 maxi 级质粒纯化方案，为科研和早期药物发现阶段提供更高效、可重复的质粒制备路径。

应用背景：从手工柱式到全自动质粒纯化

手工柱式方法的局限

  • 需要多次离心和/或真空抽滤，强依赖人工操作；
  • 多个管与柱间的转移步骤增加操作风险与交叉污染概率；
  • 难以在短时间内处理多份 100–200 mL 级别的培养液；
  • 实验人员被重复性工作“绑在”离心机旁，效率有限。

在对质粒质量（超螺旋比例、内毒素水平、残留基因组 DNA）要求不断提高的背景下，开发可靠、自动化的 maxi 级质粒纯化解决方案尤为重要。

 

KingFisher PlasmidPro Maxi Processor 自动化方案

KingFisher PlasmidPro Maxi Processor 采用与 Invitrogen™ PureLink™ Expi Endotoxin-Free Maxi Plasmid Purification Kit 相同的化学体系，通过预装一次性卡匣整合裂解、中和、澄清、结合、洗涤、内毒素去除和洗脱等步骤：

  1. 插入预装试剂卡匣；
  2. 将过夜培养液倒入指定培养槽；
  3. 选择程序并启动运行；
  4. < 75 分钟内获得洗脱好的质粒 DNA，无需离心或真空步骤。

实验方法与结果

实验设计概述

研究采用 4 种不同大小的质粒 A–D（约 2.7 kb、5.1 kb、6.6 kb、11.4 kb），分别转化至大肠杆菌 TOP10 或 DH5α 菌株，通过 150 mL 规模的 LB 过夜培养获得菌体。每种质粒分别使用：

  • KingFisher PlasmidPro Maxi Processor 搭配 endotoxin-free 预装卡匣进行自动化纯化；
  • PureLink Expi Endotoxin-Free Maxi 柱式试剂盒进行手工柱纯化（对照）。

共完成 74 次自动化抽提，分布于 9 台独立的 KingFisher PlasmidPro Maxi Processor 仪器上，以评估系统的重现性与跨仪器一致性。

 

细菌培养与样本制备

  • 菌株：
    • One Shot™ TOP10 Chemically Competent E. coli：质粒 A、B、D；
    • MAX Efficiency™ DH5α Competent Cells：质粒 C。
  • 抗生素选择：
    • 质粒 B：100 µg/mL 羧苄青霉素（carbenicillin）；
    • 质粒 A、C：100 µg/mL 氨苄青霉素（ampicillin）；
    • 质粒 D：50 µg/mL 卡那霉素（kanamycin）。
  • 培养条件：
    • Gibco™ LB Broth（1×），37°C，225 rpm 振荡培养 14–16 h；
    • 终点 OD600：2.3（A）、2.8（B）、3.1（C）、2.8（D）。
  • 每份培养液取 150 mL 进行下游纯化。

质粒 DNA 产量与光谱纯度

利用 NanoDrop Eight UV-Vis 分光光度计测定 KingFisher 纯化质粒的总产量及 A260/A280、A260/A230 比值，并与手工柱法进行对比。

 

主要发现：

  • 4 种质粒在自动化流程中均获得与传统柱法相当的总产量，即使对 150 mL 大体积培养液亦能达到期望的 maxi 级产量范围；
  • 所有样品的 A260/A280 比值均 >1.8，A260/A230 比值均 >2.0，满足大多数下游应用对蛋白与有机物污染的控制要求。

pDNA 结构形式（超螺旋比例）与 RNA/gDNA 污染

1% 琼脂糖凝胶（75 V，75 min）用于观察质粒结构形式与杂质。

 

结果表明：

  • 所有代表性样品均以超螺旋形式为主，未见明显 RNA 或基因组 DNA 条带；
  • 经密度分析，使用 KingFisher PlasmidPro Maxi Processor 纯化的质粒中，超螺旋形式占比 >80%，与手工柱式方法获得的 88% 平均值相当；
  • 这表明自动化流程能够在 maxi 规模下保持适用于高效转染和体外转录的高质量超螺旋 pDNA。

残留大肠杆菌基因组 DNA

采用 qPCR（Applied Biosystems™ TaqMan™ ECs4157 单拷贝基因检测体系）定量分析质粒制备中的残留 E. coli 基因组 DNA（gDNA）：

  • 对 37 份代表性样本（质粒 B、C、D）进行检测；
  • KingFisher 自动化纯化样品中残留 gDNA 含量与手工柱法相比差异在 ±1% 以内；
  • 说明在自动化条件下，KingFisher PlasmidPro Maxi Processor 同样具备高效去除宿主 DNA 的能力，满足对残留杂质敏感的下游应用需求。

内毒素水平评估

使用 Endosafe™ nexgen-PTS™ 内毒素检测系统测定 26 份代表性样本中内毒素含量，并与相同培养液经手工柱式纯化所得质粒进行对比：

  • 所有由 KingFisher PlasmidPro Maxi Processor 纯化的样品内毒素水平均 <0.1 EU/µg，符合“endotoxin-free（高级转染级）”标准；
  • 结果与相应的柱式纯化样品高度一致，部分质粒（如 D）自动化流程所得内毒素水平甚至低于手工方法（手工对照值约 0.081 EU/µg）。

这得益于预装卡匣中专用的内毒素去除缓冲液，可在自动流程中有效中和并去除脂多糖杂质。

 

质粒转染效率评估

通过 HuH-7 肝细胞系转染实验验证自动化制备质粒的功能表现：

  • 细胞条件：DMEM 低糖培养基 + 10% FBS，种板密度 10,000 cells/well；
  • 质粒与转染：
    • 质粒 B：携带分泌型碱性磷酸酶（SEAP）报告基因；
    • 质粒 C：携带萤火虫荧光素酶报告基因；
    • 每孔加入 100 ng 纯化质粒，使用 Lipofectamine™ 3000 与 Opti-MEM™ 配制转染体系；
  • 培养 20–24 h 后检测：
    • 质粒 B：Phospha-Light™ SEAP Reporter Gene Assay 测 luminescence；
    • 质粒 C：Luc Screen™ Extended-Glow Luciferase Reporter Gene Assay 测 bioluminescence；
  • 转染效率以手工柱式纯化质粒组设为 100% 进行相对比较。

结果：

  • 使用 KingFisher PlasmidPro Maxi Processor 纯化的质粒 B 和 C，在 SEAP 和 luciferase 表达水平上与手工柱法样品相当；
  • 相对转染效率中位数均接近或略高于 100%，显示自动化流程不会降低质粒在哺乳动物细胞中的功能表现。

应用场景

基于上述质量和功能评价，KingFisher PlasmidPro Maxi Processor 适用于多种需要高质量、低内毒素 pDNA 的研究场景：

  • mRNA 药物与疫苗研究：体外转录模板质粒的快速制备，提高候选序列筛选效率；
  • DNA 疫苗与基因治疗载体开发：支持超螺旋比例高、残留 gDNA 和内毒素受控的质粒制备；
  • 重组蛋白与抗体表达：为瞬时转染表达系统提供稳定、可重复的质粒来源；
  • 病毒载体生产（如 AAV、慢病毒）：多质粒共转染所需的高质量质粒库构建；
  • 工艺开发与放大研究：在早期研究阶段建立与后续放大流程兼容的质粒纯化策略；
  • 多项目并行实验室平台：在有限人力下支持多批次 maxi 级质粒制备，减轻人员负担。

优势亮点

全自动、免离心的一体化流程

  • 无需离心或真空抽滤，减少设备依赖和手动操作；
  • 预装一次性卡匣整合裂解、中和、澄清、结合、洗涤、内毒素去除和洗脱步骤；
  • 操作流程高度简化：插入卡匣 → 倒入培养液 → 按下 Start，即可在 <75 min 内获得可用质粒。

高质量质粒，满足高要求下游应用

  • 产量与柱式方法相当，可覆盖 150 mL LB 培养体积；
  • A260/A280 >1.8，A260/A230 >2.0，指示蛋白和有机物残留低；
  • 超螺旋形式占比 >80%，适合转染和体外转录；
  • 残留大肠杆菌 gDNA 含量与柱式方法相当，差异在 ±1% 内；
  • 内毒素水平 <0.1 EU/µg，达到 endotoxin-free（advanced transfection grade）标准。

可重复性与跨仪器一致性

  • 74 次抽提分布于 9 台仪器，仍能保持稳定的产量和质量分布；
  • 适合多实验室、多仪器部署，保证不同团队间的结果可比性。

节省人力与时间成本

  • 大幅减少手动离心、换管和柱操作时间；
  • 实验人员可在系统运行期间并行处理其他任务，提高整体工作效率。

小结

本研究系统评估了 KingFisher PlasmidPro Maxi Processor 在 2.7–11.4 kb 不同大小质粒的大体积自动化纯化表现，结果显示：

  • 在产量、光谱纯度、超螺旋比例、残留 gDNA、内毒素含量和 HuH-7 细胞转染效率等关键指标上，其表现与传统手工柱式方法高度一致；
  • 自动化流程同时消除了多次离心和真空过滤步骤，大幅降低劳动强度并提升工作效率；
  • 所得质粒质量满足蛋白生产、mRNA 合成、疫苗开发研究以及细胞与基因治疗等多种高要求应用需求。

对希望在研究或早期工艺开发阶段提升质粒制备效率和质量控制水平的实验室而言，KingFisher PlasmidPro Maxi Processor 提供了一种可靠、可扩展的解决方案。