测序前用于突变扫描的高分辨率熔解分析

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对遗传变异进行详细表征，对于理解和治疗遗传性疾病及相关状况正变得越来越重要。这也有助于开发可用于药物开发和个体化医学的生物标志物。Sanger DNA 测序仍然是确定 DNA 片段精确遗传序列的最直接、可靠的方法；但该方法通常需要投入较多时间和材料。突变扫描策略旨在快速、高效地扫描来自多个个体的 DNA 样本，以发现细微遗传变异，并识别需要进一步进行完整测序分析的候选样本。

图 1. 采用 HRM 预筛查进行遗传变异分析的工作流程概览。

随着更高亮度 DNA 结合染料、可在更精细温度分辨率下采集荧光数据的实时荧光定量 PCR 仪器，以及直观软件平台的推出，高分辨率熔解（HRM）分析正在成为大规模样本遗传变异扫描的优选方法。该流程包括在含有荧光 dsDNA 结合染料的反应体系中，将目标基因扩增为 80-250 bp 片段。

PCR 后，退火后的反应产物会逐渐变性（即熔解），随着 DNA 转变为单链而导致的荧光下降会被实时测量。所生成的高分辨率熔解曲线形状会随 DNA 序列不同而变化，从而提供能够区分仅相差单个碱基对扩增子的数据信息。 HRM 分析可用于检测单核苷酸多态性、插入、缺失和倒位等细微遗传变异。如需全面了解 HRM 分析，包括实验设计、优化和技术问题排查等信息，可访问 www.appliedbiosystems.com/hrm 下载 Applied Biosystems HRM 分析指南。

与测序、变性高效液相色谱（dHPLC）和变性梯度凝胶电泳（DGGE）等其他突变扫描技术相比，HRM 流程更简便、耗时更短，并且试剂消耗显著更少。其重复性高于 dHPLC 或 DGGE，对研究人员的优化和判读要求也更低。在某些情况下，HRM 还可提供更高的准确性和灵敏度。此外，HRM 分析采用闭管流程，可大幅降低来自先前 PCR 产物的污染风险。由于 HRM 分析不会破坏样本，因此尤其适合用于遗传变异扫描。HRM 流程可识别需要进一步研究的样本，而 PCR 反应产物随后可作为 DNA 测序模板使用，仅需最少的下游处理。本应用说明概述了这一工作流程：先使用 HRM 突变扫描检测基因组变异，再进行 Sanger 测序分析（图 1）。该流程采用 Applied Biosystems HRM 筛查试剂。与其他市售染料和酶混合物相比，这些试剂不仅性能更优，而且已在支持 HRM 的 Applied Biosystems StepOne™、StepOnePlus™、7500 Fast、7900HT Fast 和 ViiA™ 7 实时荧光定量 PCR 系统上经过广泛测试和优化。数据通过 Applied Biosystems High Resolution Melt Software 进行分析，以识别可使用我们行业领先的 DNA 测序试剂和毛细管电泳系统进行精准 DNA 序列分析的样本。

使用 HRM 分析建立突变扫描实验时，关键的第一步是设计 PCR 引物，以扩增目标基因组区域中的重叠片段。引物设计步骤中的重要考虑因素包括设计合适大小的扩增子，并遵循已确立的高质量 PCR 引物设计规范。

选择相互重叠的 80-250 bp 靶区域

HRM 分析适用于约 120-300 bp 范围内的扩增子；该大小对应于使用约 20-40 nt PCR 引物扩增的 80-250 bp 基因组 DNA 靶序列。扩增子长度需要取得平衡：既要足够短，以产生简单、易于分析的熔解图谱；又要足够长，以尽量减少覆盖目标序列所需的单个扩增子数量。较大的序列变异可能可在长度超过约 300 bp 的扩增子中检测到；但更细微的变异，例如 A/T 类 4 SNP，通常只能在较小的扩增子中检测到。由于表现出遗传变异的扩增 PCR 片段将进一步通过 Sanger DNA 测序分析，因此可考虑在每条 PCR 引物的 5’ 端加入 M13 通用测序引物尾序列。 这样可显著减少工作流程中 DNA 测序部分的移液步骤，因为加入 M13 尾序列后，所有样本都可使用通用 M13 测序引物进行测序，而无需为每个扩增子使用特异性引物。额外的 M13 序列不会影响 HRM 分析结果；不过，与扩增子序列发生任何变化一样，它会在一定程度上改变熔解图谱的形状（图 2）。在 PCR 引物中加入 M13 序列的缺点是会使扩增子长度增加 36 bp（每条 PCR 引物增加 18 nt），从而减少每个扩增子所覆盖的基因组查询序列量，并可能增加覆盖目标基因组区域所需的扩增子数量。为尽量降低漏检遗传变异的可能性，建议扩增子之间至少重叠 25 bp。图 3 展示了 PCR 引物和扩增子的设计。

遵循 PCR 引物设计规则并测试引物

基于 HRM 的筛查所采用的 PCR 引物设计，遵循适用于其他 PCR 应用的一般指南（参见通用 PCR 引物设计指南）。Applied Biosystems Primer Express Software 是辅助引物设计流程的理想工具。建议为每个扩增子设计三组引物，并通过经验性测试确定最稳健的一对。可同时采用传统低分辨率熔解曲线分析和琼脂糖凝胶电泳，测试目标序列是否发生特异性扩增，并尽量减少引物二聚体和非特异性扩增。

使用 HRM 分析进行突变扫描是一个相对简单、直接的流程。以下简要概述该流程步骤；逐步操作说明可参见 Applied Biosystems High Resolution Melting Getting Started Guide（P/N 4393102）。

DNA 样本质量和用量

由于 HRM 是一种高度灵敏的技术，应尽量通过在每个 PCR 反应中使用相近质量的 DNA，并将其置于相当体积的低盐缓冲液中，以减少实验变异。使用 Applied Biosystems MeltDoctor™ 试剂时，建议每个反应使用 20 ng DNA。DNA 分离过程中残留的盐类和其他化学物质也会影响熔解图谱；因此，应使用污染物残留最少的 DNA 分离技术，并使用同一种技术从所有样本和对照中获取 DNA。

重复和对照

与大多数基于 PCR 的技术一样，建议每个扩增反应至少设置三个重复，并同时设置无模板对照。同样，如果条件允许，应为每个基因组区域加入一个已知变异对照。由于大多数样本可能为野生型，加入一个基因组变异对照可证明在所查询的每个基因组区域中突变均可被检测到。为提高被识别为遗传变异样本的可靠性，适用于 7900HT 系统的 Applied Biosystems High Resolution Melt Software v2.0、适用于 StepOne™、StepOnePlus™ 和 7500 Fast 系统的 High Resolution Melt Software v3.0，以及适用于 ViiA™ 7 系统的 ViiA™ 7 Software HRM 模块，均可设置为使用最多 5 个不同野生型反应的数据进行样本比较。

PCR 扩增

非特异性扩增会使 HRM 分析复杂化；因此，除为每个扩增子选择高度合适 PCR 引物对之外，专为 HRM 分析设计的 PCR 试剂还可在准确性、特异性和重复性方面提供优势。MeltDoctor™ HRM 试剂专为高分辨率熔解分析而开发。这些试剂采用 MeltDoctor™ HRM 染料，即 SYTO 9 染料的稳定形式。SYTO 9 是 Molecular Probes 开发的新一代 dsDNA 结合染料，可提供清晰、干净的熔解图谱。使用最简便的是 MeltDoctor™ HRM Master Mix；开始 PCR 前只需加入模板 DNA 和一对 PCR 引物。当反应需要更高灵活性时，MeltDoctor™ HRM Reagent Kit 可分别提供酶、荧光染料和 dNTP 混合物。两种试剂组合均采用支持热启动的 DNA 聚合酶，可最大限度减少非特异性产物形成，并允许在室温下配制反应。应合理规划实验，在条件允许时尽量将 PCR 引物和其他试剂配制成 Master Mix，以减少移液操作。建议在 20 μL PCR 反应中使用每条 PCR 引物 200 nM 和 20 ng 基因组 DNA。

扩增反应建议运行 40 个循环，以产生足够用于熔解分析的材料。理想情况下，扩增应在实时荧光定量 PCR 仪器上进行，以便在必要时排查问题；但由于扩增过程中不采集数据，如有需要，也可在普通热循环仪上完成 PCR 循环。不过，熔解分析（解离）必须在支持 HRM 的实时荧光定量 PCR 仪器上进行。

表 1. HRM PCR 引物设计指南。

HRM 分析

在熔解曲线的 HRM 阶段，双链扩增子会缓慢变性，释放结合的 dsDNA 结合染料。实时荧光定量 PCR 仪器测量荧光信号的下降，HRM 软件则绘制荧光信号随温度变化的图形。图 4 显示了一个 HRM 数据示例：使用针对 NAT2 基因 121 bp 区域的 PCR 引物，对 24 个样本各 4 个重复进行扩增后生成的数据。图 4A 显示原始熔解曲线。随后，Applied Biosystems HRM Software v2.0 通过对齐 100% 和 0% 双链扩增子的荧光值来对数据进行缩放。必要时，用户可以检查并调整与这些荧光值相关的温度截止值。图 4B 显示对齐后的熔解曲线图。在该视图中，变异 DNA（红线）的熔解（解离）曲线可与众多野生型样本区分开；而当软件通过显示参考样本与其他熔解曲线之间的荧光差异来生成差异图时，这种差异会更加明显，如图 4C 所示。

图 2. PCR 引物添加 M13 尾序列会改变熔解图谱，但不会改变结果。(A) 图中显示同一靶标的 HRM 分析数据，该靶标分别使用 5’ 端添加和未添加 M13 通用 DNA 测序尾序列的 PCR 引物扩增。在两组数据中，纯合野生型、纯合突变型和杂合型的熔解图谱均可彼此区分；但由于扩增子序列不同，曲线略有差异。(B) 图 A 所示杂合子 PCR 产物的 Sanger 测序数据。

图 3. 通过 HRM 进行突变扫描的 PCR 引物和扩增子设计。设计引物，使每个扩增子最多查询 250 bp 的基因组靶序列。扩增子之间应包含至少 25 bp 的重叠，以降低漏检扩增子之间遗传变异的可能性。

通过 HRM 扫描发现含有突变的 PCR 产物，可进一步通过 Sanger 测序进行分析。在许多情况下，HRM 分析得到的 PCR 产物在测序前只需稀释，通常无需纯化。这是因为对于小于约 300 bp 的扩增子，DNA 必须稀释超过 1:20，才能获得适用于测序反应的模板浓度。这种稀释会将残留 PCR 引物和 dNTP 的浓度降低至对测序反应而言可忽略的水平。

对于 HRM 反应产物测序，我们建议使用 BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit 进行快速重测序，该试剂盒非常适合配合快速电泳运行模块分析短 PCR 产物（见图 5）。此外，v1.1 试剂盒经过设计，可在靠近测序引物的位置实现极佳碱基识别，从而避免遗漏序列起始处的前几个碱基。

快速、经济的突变扫描结合快速测序

与 dHPLC、DGGE 和直接 DNA 测序等上一代突变扫描方法相比，HRM 可提供一种显著更简便、成本更低的方法，用于快速发现新的遗传变异。Applied Biosystems 现可提供一整套专为 HRM 应用设计的试剂和软件，适用于突变扫描、甲基化分析和基因分型等应用。 这些软件和试剂专为 Applied Biosystems StepOne™、StepOnePlus™、7500 Fast、7900HT Fast 和 ViiA™ 7 实时荧光定量 PCR 系统设计，可提供直观的用户界面和可靠的仪器性能，帮助您对结果更有信心。HRM 是一种非破坏性流程，因此被识别为需要进一步研究的 HRM 反应产物可直接测序；在测序前无需额外扩增，并且在许多情况下无需额外纯化。此外，借助 Applied Biosystems 快速测序试剂和毛细管电泳仪器，包括全新的 3500 Series Genetic Analyzers，DNA 测序可在一天内完成。从优化的塑料耗材到酶反应试剂盒，从直观而强大的软件到创新型仪器，Applied Biosystems 可为您提供所需工具，支持灵敏、快速的突变扫描，并随后通过 Sanger DNA 测序确认和表征新的遗传变异。

图 4. HRM 数据示例。在 Applied Biosystems 7500 Fast 实时荧光定量 PCR 系统上，对 24 个样本各 4 个重复中的人 NAT2（N-乙酰转移酶 2）基因 121 bp 区域进行扩增。所有图像均使用 Applied Biosystems HRM Software v2.0 生成：(A) 原始熔解（解离）曲线；(B) 对齐后的熔解曲线；(C) 差异图。