荧光 Western blot 入门指南：新手使用 Alexa Fluor Plus 与 iBright FL1500 的实用攻略

Western blot 是蛋白分析中最常用的技术之一。传统上，多数实验室采用化学发光进行条带检测；然而，随着数字成像系统和荧光标记抗体的发展，荧光检测在信号稳定性、重现性以及多重检测能力上的优势日益突出。

• 信号来源：化学发光依赖酶促反应产生的间接信号，荧光检测则直接来自荧光团发射。
• 信号持续时间：化学发光信号通常在几分钟至数小时内衰减，而荧光信号在适当保存下可稳定数天至数周。
• 定量与多重检测：化学发光通常为单通道检测；荧光检测可在同一膜上同时检测多个目标蛋白，并通过内参实现更准确的归一化。

配合如 Invitrogen™ iBright™ FL1500 Imaging System 等多通道数字成像仪，以及种类丰富的 Alexa Fluor™/Alexa Fluor™ Plus 荧光二抗，科研人员可以在不改变经典 WB 流程的前提下，享受荧光检测带来的多重检测和高重现性优势。

在荧光 Western blot 中，背景荧光的控制尤为关键。以下建议有助于在实验一开始就搭建一个“低背景”体系。

样品上样缓冲液的选择

• 含溴酚蓝的 SDS 上样缓冲液会产生荧光信号，增加膜上的整体背景。
• 建议使用 不含溴酚蓝的荧光兼容上样缓冲液，例如 Invitrogen™ Fluorescent Compatible Sample Buffer（Cat. No. LC2570）。
• 如必须使用含溴酚蓝缓冲液，可在电泳时将染料前沿完全跑出胶外，或在转膜后将膜上含染料的下缘剪除，以减少背景。

转膜材料：选择低自发荧光膜

• 使用 低自发荧光的硝酸纤维素膜或 PVDF 膜 能显著降低背景。
• 推荐：Thermo Scientific™ nitrocellulose 膜（Cat. No. 88024, 88025）或低荧光 PVDF 膜（Cat. No. 22860）。

蛋白 Marker 与加样体积优化

标准预染蛋白 Marker 可用于荧光成像，但 过量 Marker 尤其是带有荧光条带的 Marker 会导致邻近泳道背景升高或信号串扰。

• iBright™ Prestained Protein Ladder（Cat. No. LC5615）包含 12 条重组蛋白，其中 10 条（11–250 kDa）为蓝色，可直接可见并可在可见光与近红外通道下成像；2 条（30 和 80 kDa）未染色，含 IgG 结合位点，可作为化学发光或荧光检测对照。

缓冲液纯度与膜操作规范

• 使用经过过滤的高质量封闭液与洗涤液，如 Thermo Scientific™ Blocker™ FL Fluorescent Blocking Buffer（Cat. No. 37565）以及含 0.05% Tween™-20 的 TBS 或 PBS 洗涤液，可避免颗粒沉积在膜上产生荧光“亮点”。
• 全程使用干净的钝头镊子处理膜，避免划痕和污染产生假阳性信号。
• 避免使用普通记号笔在膜上做标记，因为许多墨水会产生荧光；如果确需标记，建议使用铅笔。

抗体选择与浓度范围

• 优先选择经过 Western blot 验证的抗体，确保对目标蛋白具有特异性并适用于 WB 应用。
• 在荧光 WB 中，二抗浓度通常高于化学发光检测，推荐范围为 0.4–0.1 μg/mL（1:5,000–1:20,000）。
• Invitrogen™ Alexa Fluor™ Plus 二抗专为高信噪比和低交叉反应设计，可减少反复摸索的优化时间。

以下为通用荧光 Western blot 流程，保留了原文推荐的关键体积、时间与浓度参数，可直接用于建立或优化实验方案。

一、材料准备

• 低自发荧光膜：
  • Nitrocellulose（Cat. No. 88024, 88025）
  • 低荧光 PVDF（Cat. No. 22860）
• 封闭缓冲液：Blocker FL Fluorescent Blocking Buffer（10X，Cat. No. 37565）
• 洗涤缓冲液：含 0.05% Tween-20 的 TBS 或 PBS（如 Cat. No. 28360 或 28352）
• 一抗：经 WB 验证的一抗
• 荧光标记二抗：如 Alexa Fluor™ Plus 488/555/647/680/800 系列
• 孵育盘（如 Invitrogen™ Incubation Trays，Cat. No. LC2102）
• 成像系统：iBright™ FL1500 Imaging System 或同类多通道成像仪

小提示：用于荧光与化学发光的蛋白上样量可相同，通常为 10–50 µg 细胞/组织裂解液，根据目标蛋白丰度调整。

二、通用荧光 Western blot 步骤

1. 转膜后水洗
   • 在去离子水中洗膜 4 次，每次 5 min，轻微振荡。
2. 封闭
   • 将 10X Blocker FL 稀释成 1X（用去离子水）。
   • 膜在足量 1X 封闭液中室温摇晃孵育 15–30 min。
3. 一抗孵育
   • 按供应商建议稀释一抗，常规为 1:1,000（假设 1 mg/mL 储液）。
   • 在封闭液中配制工作液，室温孵育 1 h，或 4°C 过夜轻摇。
4. 洗涤
   • 在洗涤缓冲液中洗膜 6 次，每次 5 min。
5. 二抗配制
   • 根据目标通道配制荧光二抗，一般浓度范围 0.4–0.1 μg/mL（1:5,000–1:20,000）。
   • 示例（以 2 mg/mL 二抗储液、总量 15 mL 为例）：
     • 1:5,000：3 µL 二抗 + 15 mL 洗涤液
     • 1:10,000：1.5 µL 二抗 + 15 mL 洗涤液
     • 1:20,000：0.75 µL 二抗 + 15 mL 洗涤液
   • 二抗可用封闭液或洗涤液稀释。
6. 二抗孵育
   • 室温轻摇孵育 1 h，全程避光。
7. 再次洗涤
   • 洗涤缓冲液中洗 6 次，每次 5 min，继续避光。
8. 成像与膜的干湿处理
   • 膜可在湿膜状态下立即成像，也可干燥后再成像。
   • 使用 iBright FL1500，选择对应荧光通道及 Smart Exposure 自动曝光工具。
   • 对于 Alexa Fluor™ Plus 系列二抗，适当干燥膜可进一步提高信噪比，且信号在正确避光保存下可稳定数日到数周。

体积建议：常规孵育盘中，mini 膜每张建议至少 15 mL，midi 膜至少 30 mL，以确保完全覆盖并避免局部背景不均。

• 信号持久：荧光信号稳定，便于重复成像和长期留档。
• 结果重现性高：成像条件易于标准化，便于不同实验之间的比较。
• 支持多重检测：在同一膜上独立分辨多个目标蛋白，简化内参归一化。
• 定量更可靠：线性范围宽，结合数字成像系统和适当的内参，可获得更准确的定量结果。
• 与经典 WB 流程兼容：仅需在检测步骤改用荧光二抗和荧光成像仪，其余电泳和转膜步骤与常规 WB 基本一致。
• 适配完善的产品体系：包括低自发荧光膜、荧光专用封闭液、预染蛋白 Marker、Alexa Fluor/Alexa Fluor Plus 二抗及 iBright FL1500 成像系统等，可构建端到端的一站式解决方案。

一、高整体背景

可能原因：

• 二抗浓度过高；
• 一抗浓度过高，出现非特异条带；
• 洗涤不足，导致信噪比低；
• 膜本身或操作造成荧光污染；
• 暴光时间过长。

解决建议：

• 适当降低一抗与二抗浓度，特别是二抗；
• 增加洗涤次数和洗涤缓冲液体积；
• 在洗涤缓冲液中加入 0.05% Tween-20；
• 选择低荧光 PVDF 膜，并注意全程避免污染；
• 缩短暴光时间，或在 iBright FL1500 上使用 Smart Exposure 自动曝光。

二、背景不均匀

可能原因：

• 孵育或洗涤液体积不足，膜表面覆盖不完全；
• PVDF 膜预润湿不充分，或在操作中出现干燥。

解决建议：

• 保证 mini 膜孵育体积 ≥15 mL，midi 膜 ≥30 mL；
• PVDF 膜在转膜前充分在甲醇或乙醇中润湿并平衡于转膜缓冲液；
• 如膜在过程中意外干燥，可先短暂浸入 100% 甲醇或乙醇重新润湿，再用去离子水冲洗后继续后续步骤。

三、信号弱或无条带

可能原因：

• 一抗用量不足；
• 抗体活性下降；
• 暴光时间过短；
• 成像系统波长设置错误。

解决建议：

• 提高一抗浓度或延长孵育时间；
• 通过 dot blot 或已知阳性样本验证抗体活性；
• 适当延长暴光时间，或使用 Smart Exposure 优化参数；
• 确认成像系统选择的激发和发射波长与所用荧光染料匹配。

荧光 Western blot 在信号稳定性、多重检测能力以及定量准确性方面具有显著优势，而整体实验流程与传统 WB 高度兼容。通过：

• 选择低自发荧光膜和荧光兼容试剂，
• 合理优化一抗/二抗浓度与孵育条件，
• 使用 iBright FL1500 等多通道数字成像系统，
• 配合光谱分离良好的 Alexa Fluor/Alexa Fluor Plus 系列二抗，

研究者可以快速建立一个高信噪比、高重现性且便于多重定量分析的荧光免疫印迹平台，为信号通路研究、蛋白修饰解析及生物标志物验证等应用提供可靠工具。