&“Invitrogen 的带 EmGFP 的 BLOCK-iT™ HiPerform™ 慢病毒 Pol II miR RNAi 表达系统是我们迄今为止提供的极强大、极灵活的 RNAi 载体。”

Adam Harris 的访谈

在最近的一次访谈中，Invitrogen 科学家 Adam Harris 讨论了 Invitrogen 的全新 RNAi 载体的优势。 
 
问：与先前的慢病毒 RNAi 载体相比，Invitrogen 的全新 HiPerform™ 载体有何改进？
Harris：HiPerform™ 载体含有一个 mRNA 稳定序列 (WPRE) 和一个核导入序列 (cPPT)，它们已在不同细胞系中实现高达5倍的病毒滴度和 EmGFP 表达水平（图1）。此外，Gateway® MultiSite 技术使研究人员可以使用 CMV、EF-1a 或其自己的组织特异性启动子表达 EmGFP/miR RNAi 盒。



图 1A——带 EmGFP 的新型 BLOCK-iT™ HiPerform™ 慢病毒 POL II miR RNAi 表达系统。pLenti6.4/CMVor Ef-1a/V5-M5--GW/EmGFP-miR 载体由 CMV 启动子驱动，具有杀稻瘟菌素抗性标记物并通过共顺反子 EmGFP 表达用作报告基因。



图 1B——使用 BLOCK-iT™ HiPerform™ 慢病毒 POL II miR RNAi 表达系统的 pLenti6.4 结构体的荧光明显更亮。  在 MOI 为3时转导 GripTite™ 293 细胞及各自病毒后4天拍摄的图像。

问：HiPerform™ 表达系统有哪些特有的其他特性？
Harris：与之前系统一样，研究人员能够通过带 EmGFP 的共顺反子表达来追踪 miRNA 表达，通过单个转录物中多个 miRNA 的表达同时敲低超过一个基因。 但是，借助全新的 HiPerform™ 系统，另一个关键特性脱颖而出：杀稻瘟菌素抗性由小鼠 PgK-1 启动子表达，以避免在多次传代后关闭。

问：该载体适用于体内应用吗？
Harris：RNAi 应用领域似乎正在发生变化，因为证明动物的表型改变也验证体外结论。全新 HiPerform™ 系统的 MultiSite 功能使您可以将组织特异性和其它受管制启动子轻松插入系统中。


问：具体来说，WPRE 和 cPPT 元件如何帮助提高滴度？
Harris：cPPT 是 HIV-1 的中心多嘌呤束，经证明，此序列对将原病毒导入细胞核非常重要。 原则上，其在缓慢分裂或不分裂的细胞中效果最好。 WPRE 是土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件，经证明，其可以稳定和/或改善来自细胞核的病毒转录物的导出。WPRE 极大地增强了其所在的转录物的表达。

问：在使用 HiPerform™ 系统时，您通常如何测量滴度？
Harris：我们使用流式细胞分析计算滴度（单位为 GFP（传染或转导单位数/ml））。 通常，使用少量病毒转导靶标细胞，以使转导的细胞少于 30%。 然后，根据得分为 GFP 阳性（在大多数情况下，因使用一份病毒颗粒所导致）的细胞数和应用的病毒上清液体积计算转导单位数/ml。

问：您是否因 GFP 表达较高而错误得出滴度较高的结论？
Harris：嗯，使用 HiPerform™ 系统时，GFP 表达确实较高，但将前一系统与新系统比较时，我们能够将敲低活性与 GFP 滴度相关联。 这表明我们对滴度的评估不仅仅依靠对转导细胞中 GFP 的更好检测。

问：您能否简单介绍一下 HiPerform™ 工作流程？
Harris：我们全新 HiPerform™ 系统和其他慢病毒表达系统的典型工作流程包括设计和订购对前体 microRNA 编码的两个 64nt DNA 寡核苷酸。 （编者注记：这些寡核苷酸可以通过 Invitrogen 的 RNAi Designer 在 www.invitrogen.com/rnaidesigner 上方便地设计和订购）。然后，对这些寡核苷酸退火并在有效的五分钟连接步骤中克隆成适应 miRNA 侧翼区域的 pcDNA 载体。  获得的 pcDNA 载体（携带 CMV 启动子）可立即用于转染以进行敲低筛选。 人们将选择一种或两种最有效的 miRNA 序列继续用于慢病毒。 一旦确定了该序列，该载体将通过 Gateway® 重组反应与 CMV、EF-1a 或 HiPerform™ 慢病毒目的载体的其他目标启动子一起转移。 根据我之前的介绍，从获得的慢病毒表达克隆体中生产和滴定病毒。 然后，使用该病毒来转导细胞。 对于短期敲低，不必进行任何种类选择；但对于长期敲低，我们选择使用抗生素或使用 FACS 分选出 GFP 阳性细胞。然后，通过 qPCR 或 Western 印迹等方法收获这些细胞以验证敲低效果。由此，我们可以通过敲低该目标基因来评估生成的表型。


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