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用于临床肿瘤研究等应用中 DNA 甲基化分析的定制 NGS panel
除单核苷酸变异（SNV）、拷贝数变异（CNV）以及插入和缺失（indel）等遗传变异之外，基因组表观遗传分析还可为生物标志物检测提供另一层信息。DNA 甲基化是研究最为广泛的表观遗传生物标志物之一，其中研究最多的甲基化形式是 DNA 中 CpG 位点（胞嘧啶后接鸟嘌呤的二核苷酸）上的 5-甲基胞嘧啶。
与 DNA 变异生物标志物测序相比，基因组中的 DNA 甲基化生物标志物图谱绘制通常被认为更具挑战性，因为表观遗传图谱通常比 DNA 序列变异表现出更高的可变性。虽然每个人只有一个基因组，但甲基化组会随年龄和组织类型而变化，也可能受到环境因素影响，并且常在疾病中呈现特征性异常。
这些 DNA 甲基化变化可通过 靶向 NGS进行研究，从而绘制个体在不同年龄、不同组织类型以及不同疾病状态下的甲基化组图谱。此类研究有望为衰老和疾病发生机制提供有价值的信息。
使用下一代测序分析 DNA 甲基化有哪些方法？
针对 DNA 甲基化这一复杂问题，目前已有多种分子检测方法，并且这些技术也在不断发展。常用的 DNA 甲基化分析方法包括亚硫酸氢盐转化、基于抗体或 5-甲基胞嘧啶结合蛋白的甲基化 DNA 纯化，以及使用甲基化敏感性限制性内切酶进行酶切。这些方法中的每一种都可结合靶向 下一代测序（NGS）或其他分子检测方法进行后续分析，例如 Sanger 测序、定量 PCR（qPCR）或基因芯片。针对具体情境选择合适方法，需要综合考虑多种因素以及各方法的优缺点，详见下方表 1。.
下文将更详细地介绍可在 Ion Torrent 平台上进行分析的三种 DNA 甲基化图谱分析策略。研究靶标数量以及所需分辨率水平，将决定哪种解决方案最适合您的需求。
通过亚硫酸氢盐转化和基于扩增子的靶向测序，使用 NGS 进行靶向 DNA 甲基化分析，可针对目标靶标实现单核苷酸分辨率的定量甲基化分析。
Ion GeneStudio S5 系统 和 Ion Torrent Genexus 系统 上的 Ion AmpliSeq 靶向测序技术，可提供量身定制、准确、快速且易于使用的靶向 DNA 甲基化分析解决方案。这些方法还兼容低 DNA 起始量，因此特别适用于临床肿瘤研究等临床研究应用，因为此类研究中可用生物样本通常有限。
| 亚硫酸氢盐转化 | 亲和富集 | 限制性内切酶 | |
| 概述 | 亚硫酸氢盐处理会将未修饰的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而甲基化胞嘧啶受到保护并保持不变。 | 使用抗体和甲基化 CpG 结合蛋白捕获并富集甲基化基因组区域，用于后续分析。 | 使用甲基化敏感性限制性内切酶切割识别位点，留下完整的甲基化或非甲基化序列用于分析。 |
| 分辨率 | 单碱基 | 约250 bp | 单碱基 |
| 覆盖的 CpG 位点 | >2,800 万个 CpG | 约 2,300 万个 CpG | 约 200 万个 CpG |
| 优点 | 可通过全基因组亚硫酸氢盐测序评估每个 CpG 位点，或使用定制 panel 仅靶向关注的 CpG 位点。 |
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灵敏度高且成本较低 |
| 局限性 |
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不覆盖缺乏酶切限制位点的区域 |
表 1. DNA 甲基化图谱分析全基因组方法比较。改编自 Barros-Silva D 等，Genes 9:429（2018）。
使用亚硫酸氢盐转化 NGS 进行 DNA 甲基化分析的分步指南
第 1 步：设计实验
在用于 DNA 甲基化分析的亚硫酸氢盐转化 NGS 工作流程中，第一步是设计定制 panel，以满足您独特的临床研究需求。如果您处理的是人类样本，可以使用与领先临床癌症研究人员合作预设计并预测试的 Ion AmpliSeq Methylation Panel for Cancer Research community panel，也可以自行设计用于 DNA 甲基化分析的定制 Ion AmpliSeq panel。这两种选择均可通过 Ion AmpliSeq Designer 工具获得，您可访问 ampliseq.com 使用该工具。使用您的赛默飞账户用户名和密码登录；如果尚无账户，也可在几分钟内免费创建账户。
如果您的项目较为复杂，或您处理的是非人类样本，请联系销售代表安排时间，与我们的技术团队讨论项目细节。
第 2 步：亚硫酸氢盐转化
接下来，需要进行亚硫酸氢盐转化步骤。许多临床研究人员会选择使用商业化试剂盒完成此步骤，例如 MethylCode Bisulfite Conversion Kit。使用该试剂盒可快速、简便地将 DNA 样本中的非甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶，同时使甲基化胞嘧啶保持不变。 经修饰的 DNA 非常适合用于 NGS，并兼容 NGS 分析以及其他下游分子分析方法，例如 PCR 扩增、限制性内切酶酶切和基因芯片。
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第 3 步：NGS 文库制备和模板制备
亚硫酸氢盐转化之后，工作流程的下一步是通过文库制备和模板制备步骤，为 NGS 准备样本。
如果您使用的是 Ion GeneStudio S5 系统之一，可以手动进行文库制备，也可以使用 Ion Chef 系统实现文库制备自动化。完成文库制备后，您将使用 Ion Chef 仪器进行模板制备和芯片上样。
如果您使用 Ion Torrent Genexus 系统，Genexus 一体化测序仪会在自动化工作流程中同时完成 NGS 文库制备和模板制备步骤。设置运行仅需约 10 分钟手动操作时间，随后仪器会自动完成文库制备、模板制备、测序、分析和报告生成；约 24 小时后即可查看报告。
第 4 步：执行下一代测序
定制 Ion AmpliSeq DNA methylation panels 同时兼容 Ion GeneStudio S5 系统和 Ion Torrent Genexus 系统。临床研究人员选择 GeneStudio 平台，是因为其具备灵活性和可扩展性，并且作为一款主力台式 NGS 系统具有出色性能。GeneStudio 平台已广泛建立应用基础，并获得全球实验室众多研究发表文献支持。
The Genexus 系统因其简便性而被临床研究人员选择：从亚硫酸氢盐转化后的 DNA 到报告生成，仅需一个接触点，手动操作时间短至 10 分钟；同时其 NGS 工作流程快速，最快约 24 小时即可获得 DNA 甲基化生物标志物结果。该创新型 NGS 平台为临床研究实验室带来易用性和自动化能力，使全球更多实验室能够在内部开展 NGS 检测。
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第 5 步：分析数据
使用 methylationAnalysis plugin 分析 Ion AmpliSeq Methylation Panel for Cancer Research 或定制 Ion AmpliSeq DNA methylation panels 的测序输出。该插件可从 Thermo Fisher Scientific Plugin store获取。
methylationAnalysis plugin 可对 Watson（W）链和 Crick（C）链上的扩增子进行比对和甲基化识别。每个扩增子可以包含零个、一个或多个指定的关注 CpG 靶标（热点）。汇总报告会显示每个条形码名称及其样本名称、覆盖目标 CpG 的总 reads 数，以及其中发生甲基化的 reads 百分比。此外，还会为每个条形码生成文本文件，提供每个扩增子的甲基化 reads 数、非甲基化 reads 数以及甲基化百分比。
仅供科研使用。不可用于诊断程序。
PMR: 005314