内容总结：

  1. 介绍细胞结构及活细胞成像常用的工具
  2. 讲解实验中的常见问题和解决方案

演讲者：李琳子 博士 —— 赛默飞技术应用科学家

类型: 技术讲座

难度: 中级

目标受众: 生命科学研究人员、细胞成像使用者、细胞生物学与药理学实验人员

[00:00-09:59] 讲座开场方法: 路线和荧光概念: 及研究范围和流程

[10:00-16:59] 探针选择方法: 抗体和蛋白: 及BacMam导入和兼容性

[17:00-24:59] 染色流程: 样品和多重标记: 及光谱工具和通道选择

[25:00-34:59] 成像注意事项: 漂白和光毒性: 及细胞膜染色方法

[35:00-44:59] 细胞骨架方法: 标记和操作视频: 及溶酶体和自噬方法

[45:00-53:59] 细胞器方法: 线粒体和ER/Golgi: 及外泌体染色和资源

学习目标：

  1. 掌握荧光探针类型及选择要点
  2. 理解BacMam导入的操作和适用场景
  3. 掌握细胞染色流程及孵育条件优化
  4. 学习多重标记的通道选择和光谱匹配
  5. 理解背景荧光、光漂白和光毒性对策
  6. 掌握细胞器标记方法及典型应用

基础概念：

  1. 荧光激发与发射: 荧光体吸收短波激发后以长波发射，能量损失导致发射波长更长。
  2. BacMam基因导入技术: 去毒杆状病毒包装表达载体并感染哺乳细胞，实现融合荧光蛋白活细胞表达。
  3. 荧光偶联物/小分子染料: 荧光素偶联毒素、配体或凝集素等，依赖特异结合标记细胞结构。
  4. pH依赖性染料: 在中性荧光弱、酸性增强的染料，用于内吞与酸化过程示踪。
  5. LC3串联传感器: RFP-GFP-LC3报告蛋白，酸性环境淬灭GFP保留RFP，用于自噬流分析。
  6. 光漂白: 荧光因持续照射衰减，需选用稳固染料并降低光强和曝光。
  7. 光毒性: 成像光照导致细胞损伤与结构变化，需优化光路与时长。