内容总结：

讲座围绕流式细胞仪光学与荧光原理展开，介绍激发与发射的基本过程。系统梳理有机染料、荧光蛋白、大分子染料、量子点和复合染料的特点与适用性。重点解释相对荧光亮度与染色指数的计算及其对仪器配置、激光功率、滤光片和背景信号的依赖。结合外周血免疫分型案例，给出多色配色的流程与策略，包括仪器通道选择、亮度与抗原匹配、光谱重叠最小化、复合染料稳定性问题及补偿调整。

演讲者：王臻 博士 流式细胞仪技术应用专家

类型: 技术讲座

难度: 中级

目标受众: 流式细胞研究人员、免疫学与临床实验室技术人员

[00:00-02:25] 流式细胞仪结构及原理

[02:25-20:00] 荧光染料：

  • 荧光染料的发光原理
  • 荧光染料的种类
  • 荧光染料的亮度，包括染色指数计算方法

[20:00-34:59]多色配色方案及实验涉设计

  • 流式在细胞水平上的应用
  • 10色配色实例

[35:00-57:59] AttuneNxT的多色应用，补偿处理和重叠注意事项

多色配色原则

  • 机器配置
  • 染料的亮度与抗原表达量相匹配
  • 荧光染料重叠最小化
  • 尽量避免复合染料联合使用带来的假阳性

学习目标：

  1. 掌握荧光激发与发射的基本流程
  2. 理解常见荧光染料的分类和特点
  3. 学习染色指数的计算方法和影响因素
  4. 掌握多色配色的流程与通道选择方法
  5. 理解光谱重叠的补偿策略与替代方案

基础概念：

  1. 荧光共振能量转移（FRET）: 复合染料中Donor向Acceptor进行能量转移，实现二次激发与发射。
  2. 染色指数（Staining Index）: 阳性中位值减阴性中位值除以阴性群宽度，用于评估流式染料实用亮度。
  3. 光谱重叠与补偿: 不同染料发射光谱互相泄漏，需要通过补偿矩阵扣除交叉信号。
  4. 量子点染料: 以纳米半导体为核心，发射光谱窄，亮度高，大小决定发射波长。
  5. 复合染料（Tandem）: 由Donor与Acceptor组合的荧光染料，色彩选择多但稳定性受连接完整性影响。
  6. 背景信号: 仪器与样本的非特异信号，会扩大阴性群宽度并降低染色指数。
  7. 声波聚焦: 通过声波实现样本对准与高流速采集，提高速度并降低堵塞风险。