内容总结：

演讲者：王苗英——赛默飞世尔科技生命科学产品技术应用专家

讲座简介：

  1. 高保真PCR基础概述
  2. 如何在PCR中获取最高的序列准确度？
  3. 面对复杂DNA模板如何成功进行高保真PCR扩增？
  4. 多重PCR反应有哪些关键的影响因素？

类型: 技术讲座

难度: 中级

目标受众: 生命科学研究人员、分子生物学实验人员、PCR与克隆相关技术人员

[00:00-09:59] PCR基础方法: 酶活性介绍及保真度定义

[10:00-18:59] 错配率测定方法: 蓝白斑和测序及优化建议

[19:00-26:59] 热启动流程: 特异性提升及室温注意事项

[27:00-34:59] 抑制剂耐受方法: 直接PCR流程及多重PCR

[35:00-40:00] 高GC与长片段方法: RT流程及扩增注意事项

学习目标：

  1. 掌握PCR酶的三种关键活性及其作用
  2. 理解保真度与错配率的定义和检测方法
  3. 学习克隆与点突变的高保真扩增策略
  4. 掌握热启动技术的流程和特异性提升方法
  5. 理解高持续合成能力、抑制剂耐受与直接PCR的要点
  6. 学习高GC与长片段扩增的添加剂使用与参数优化

基础概念：

  1. 5'→3'聚合酶活性: DNA聚合酶沿5'到3'方向延伸合成DNA链的能力。
  2. 5'→3'外切酶活性: 聚合酶在延伸时水解前向DNA或探针的能力，常用于TaqMan探针法。
  3. 3'→5'外切酶活性: 聚合酶的校对功能，可切除错误碱基以提高保真度。
  4. 保真度: 以错配率为依据，相对Taq的错误率倍数表示的准确性。
  5. 热启动: 通过抗体或化学修饰在高温激活酶，减少室温非特异性和引物降解。
  6. 高持续合成能力: 酶稳定结合模板不易脱落，提高延伸速度、长度和产量。
  7. GC enhancer: 用于提高高GC含量模板扩增效率的添加剂。
  8. 直接PCR: 样品无需提取和纯化，直接作为PCR模板进行扩增的流程。
  9. 多重PCR: 在同一反应中同时扩增多个靶标，节省样品和时间。
  10. FFPE样品: 甲醛固定石蜡包埋组织，DNA易降解且含抑制剂，扩增难度较高。