内容总结：

  1. 细胞自噬研究背景介绍
  2. 自噬发生过程中的常用荧光成像检测解决方案的介绍。

演讲者：赛默飞世尔技术应用专家 李琳子博士

类型: 技术讲座

难度: 中级

目标受众: 生命科学与细胞生物学研究人员、成像与免疫荧光实验人员、药物研发与筛选人员

[00:00-09:59] 蛋白表达方法: 背景和用途及常用技术

[10:00-18:59] 标签选择方法: His与GST对比及注意事项

[19:00-26:59] 亲和材料选择: Ni与Co树脂比较及洗脱方式

[27:00-33:59] 亲和纯化流程: 上样孵育和洗涤洗脱及重生

[34:00-41:59] 问题处理方法: 表达低和包含体及优化

[42:00-47:59] 问题处理方法: 纯度低和得率低及调整

[48:00-51:59] 标签去除方法: 柱上和柱下流程及利弊

[52:00-57:00] 工具选择方法: 介质对比和操作方式及放大

学习目标：

  1. 掌握重组标签蛋白亲和纯化的基本流程和关键缓冲体系
  2. 理解His与GST等常用标签的原理、优缺点及适用场景
  3. 学习Ni-IDA/NTA与Co树脂的差异与选择策略
  4. 掌握表达量低、包含体、纯度低和得率低的优化方法
  5. 理解柱上与柱下酶切的操作流程及注意事项

基础概念：

  1. 亲和纯化: 利用标签与特定配基的特异性结合实现蛋白选择性捕获和洗脱的层析方法。
  2. His标签: 由6–8个组氨酸组成的短标签，常用Ni或Co螯合树脂，通过咪唑竞争洗脱。
  3. IDA/NTA螯合树脂: IDA（三配位）与NTA（四配位）螯合Ni2+的载体，NTA更稳定，IDA产量更高。
  4. GST标签: 谷胱甘肽S转移酶标签，依赖与谷胱甘肽的结合，洗脱温和并可提升目标蛋白溶解度。
  5. 包含体: 在细菌表达中形成的错误折叠蛋白聚集，不具活性，需降低温度或复性处理。
  6. 柱上酶切/柱下酶切: 在柱上或洗脱后加入特定蛋白酶去除标签的两种操作流程，各有利弊。
  7. Superflow介质: 耐高压、可重复使用次数更多的层析介质，适用于纯化仪与更高通量操作。
  8. 磁珠与琼脂糖介质: 磁珠表面更致密非特异性低；琼脂糖多孔易引入背景，选择影响纯度。