内容总结：

课程介绍逆转录的发现历史、原理与作用，解释为何以RNA起始并转为cDNA以便后续分析。系统梳理RT-PCR、RT-qPCR、克隆与文库、芯片和RNA测序等下游应用。讲解实验设计与防降解、对照设置、反应组分清单、模板类型与用量、样本质量与抑制剂影响。说明去除基因组DNA的策略及引物选择，包括oligo(dT)、随机、基因特异性与microRNA的茎环和加尾方法。

演讲者：赛默飞技术支持专家

类型: 实验教程

难度: 中级

目标受众: 分子生物学与生命科学实验人员

[00:00-05:59] 逆转录基础流程: 发现及原理和下游应用

[06:00-11:59] 实验设计流程: 设备和防污染及对照设置

[12:00-17:59] 模板选择方法: RNA类型和用量及注意事项

[18:00-23:00] 引物选择方法: oligoDT和随机及microRNA

学习目标：

  1. 理解逆转录的原理和三步流程
  2. 掌握RT-PCR与RT-qPCR的应用场景
  3. 学习实验设计与防RNase的注意事项
  4. 掌握RNA模板类型与用量选择方法
  5. 理解去除基因组DNA的两种策略
  6. 掌握oligo(dT)、随机与特异引物的适用性
  7. 学习microRNA茎环与加尾逆转录方法

基础概念：

  1. 逆转录酶: 具RNA依赖性DNA聚合酶活性，将RNA合成cDNA的酶。
  2. 逆转录（RT）: 以RNA为模板合成cDNA的过程，含退火、延伸、酶灭活三步。
  3. cDNA: 由RNA逆转录得到的DNA，用于PCR、克隆与测序。
  4. RT-PCR/RT-qPCR: 以cDNA为模板的PCR或实时定量PCR，用于鉴定与定量。
  5. oligo(dT)引物: 与poly(A)尾结合起始逆转录，适合mRNA全长合成。
  6. 随机引物: 随机序列寡核苷酸，兼容多种RNA但全长比例较低。
  7. 基因特异性引物: 针对目标基因设计，只扩增特定产物，常用于RTPCR。
  8. 基因组DNA去除: 通过跨内含子引物或温和DNase去除gDNA，避免假阳性。
  9. RNase抑制剂: 抑制RNA酶活性，保护RNA稳定性的添加剂。
  10. microRNA茎环/加尾法: 茎环引物特异检测或加A尾配合通用引物进行逆转录。