提升您的研究所需的逆转录必备知识

逆转录指的是，以单链 RNA 为模板，在逆转录酶（RT 酶）介导下合成单链 DNA（互补 DNA，又称 cDNA）。该 cDNA 可用作 PCR 扩增或生成 cDNA 文库的模板。 

只要单链 DNA 引物杂交到 RNA 上，所有 RNA——总 RNA、mRNA、特异性 RNA、体外转录 RNA——都可转录；逆转录酶 (RT) 将以 RNA 序列为模板，从引物 3’端开始合成 DNA（图 1）。一种寡核苷酸 (dT) 引物可与大多数 mRNA 分子上的多聚腺苷酸尾结合，允许从几乎所有 mRNA 进行 cDNA 合成。对于非多聚核苷酸 RNA（如细菌 RNA），适于采用随机引物合成较大规模的 cDNA，因为其可对所有靶标 RNA 退火。  而我们也可使用基因特异性引物逆转录特异性 mRNA。RNA 引物连接策略与 RNA 纯化方法的组合，对 cDNA 合成效率、一致性和产量有重要影响。

图 1.逆转录实验方案。

常用 RT 酶为病毒产物（例如，鸟类成髓细胞增生症病毒 (AMV) 或莫洛尼鼠白血病病毒 (M-MLV) 产物）。AMV 和 M-MLV RT 酶均具有 RNase H 酶活性，从而与聚合酶竞争对 RNA 模板和 DNA 引物的杂交产物进行反应。这种竞争会减少模板-引物复合物量，造成 cDNA 产量下降。此外，RNase H 活性还可以在链合成过程中通过水解 RNA 模板来降低 cDNA 产量和长度。因此，去除 RNase 活性是提高全长 cDNA 产量的关键。 

为获得更高产量的全长 cDNA，逆转录酶经过工程改造，以便在不影响聚合酶活性的前提下，去除 Rnase H 活性。这些经过工程改造的 Rt——如 SuperScript III——具有更高的持续合成能力和更低的错配率，可在更高温度下发挥作用，从而可以解析 RNA 折叠并减少 DNA 引物的非特异性结合。

SuperScript III 相对于其他 RT 的优势是：

• 相对于其他 RT（图 2），与基因特异性引物的结合特异性最高
• 55 ℃ 反应温度，可减少二级结构
• 每次反应高达 400 单位，不会抑制后续 PCR

图 2.含 Platinum Taq 聚合酶的 SuperScript 一步法 RT-PCR 系统。采用 0.01 pg、0.1 pg、1.0 pg 和 1.0 ng 的 HeLa 总 RNA，利用制造商实验方案中规定的试剂和条件进行一步法 RT-PCR 反应。所有反应的退火温度均为 55°C。

为 cDNA 合成选择正确的逆转录酶，是获得高产量、优质、全长 cDNA 的关键。我们提供了经过专门优化的广泛 Rt，以助您获得研究所需的 cDNA（表 1）。  

表 1.不同逆转录酶的特性。