FastDigest 限制性内切酶结合 E-Gel Power Snap Plus：加速载体制备和电泳分析的一体化解决方案

说明：本文根据 Thermo Fisher Scientific 官方技术说明重组整理，以优化网页阅读结构，所有实验条件与数据保持原始准确性。

引言：从“等结果”到“快决策”的分子克隆工作流

在常规分子克隆中，为获得可供连接的插入片段和载体，研究者通常需要经历：

  • 多小时的限制性内切酶消化
  • 手工配制琼脂糖凝胶并等待凝固
  • 使用含溴化乙锭的凝胶及紫外成像观察结果

这些步骤不仅耗时，还涉及有毒染料和紫外照射，对实验人员及 DNA 样本都带来潜在风险。

 

Thermo Scientific™ FastDigest™ 限制性内切酶与 Invitrogen™ E-Gel™ Power Snap Plus 电泳系统将快速酶切和预制凝胶电泳相结合，可显著简化从样本处理到结果分析的整体流程，实现更快、更安全、更高效的克隆准备。

解决方案概述——FastDigest 酶切 + E-Gel Power Snap Plus 电泳

工作流整体提速：总时间缩短至约 1/6

以典型的克隆载体制备为例，对比传统方法与 FastDigest + E-Gel 工作流：

  • 传统方法
    • 样品准备与常规酶切：约 1 小时 29 分
    • 琼脂糖凝胶配制与凝固：需单独准备、冷却及组装电泳槽
    • 电泳运行与成像：加载样品、电泳运行、紫外观察等共计约 1 小时 11 分
    • 结果成像整理：约 15 分钟
  • FastDigest 限制性内切酶 + E-Gel 系统
    • 样品准备与 FastDigest 酶切：约 19 分钟
    • 在预制的 Invitrogen™ E-Gel™ EX Agarose Gels (1%) 上加载样品并在 E-Gel Power Snap Plus 系统上运行：约 13 分钟
    • 结果可视化：约 1 分钟

时间对比（表 1）：

  • 动手操作时间：
    • FastDigest + E-Gel：10 分钟
    • 传统方法：23 分钟
  • 总耗时：
    • FastDigest + E-Gel：37 分钟
    • 传统方法：3 小时 49 分钟

应用背景——高效载体制备的典型需求场景

在以下场景中，研究者特别需要缩短克隆准备时间、提升结果可靠性：

  • 需在短时间内完成多构建体设计与验证（如大型突变或文库构建项目）
  • 项目节奏紧张，需要快速生成可用于基金申请或论文投稿的可靠数据
  • 实验室希望减少有毒试剂（如溴化乙锭）的使用，改善实验环境安全性
  • 面对多种不同限制酶时，希望简化缓冲液体系，避免条件优化

FastDigest 限制性内切酶采用统一的 10X FastDigest Buffer，能够覆盖 176 种酶的快速、完全消化需求，可显著降低缓冲优化和条件筛选的复杂性。

实验方法与结果

一、FastDigest 快速酶切与反应体系

  1. 反应体系配置（20 μL 总体积）
    1. 无核酸酶水：15 μL
    2. 10X FastDigest Buffer：2 μL
    3. 质粒 DNA：2 μL（总量最多 1 μg）
    4. FastDigest 限制性内切酶：1 μL
    5. 总体积：20 μL
  2. 反应步骤
    1. 在室温下按表 2 配制酶切反应体系。
    2. 轻轻混匀并瞬时离心。
    3. 将反应管放入 37°C 金属浴或水浴中孵育 5–15 分钟（具体时间依据酶种和底物，请参考对应产品说明书）。
    4. 按照酶的推荐条件进行酶失活处理（温度和时间请参见产品说明书）。

说明：FastDigest 酶切体系在统一缓冲液中即可完成绝大多数酶的快速完全消化，无需更换缓冲或多次加酶。

 

二、E-Gel 预制凝胶电泳与上样准备

  1. 电泳胶与梯度
    • 使用 Invitrogen™ E-Gel™ EX Agarose Gels (1%) 预制凝胶
    • 采用 E-Gel™ 1 Kb Plus Express DNA Ladder 作为分子量标准
  2. 标准品梯度配置
    • 在 20 μL 无核酸酶水中加入 0.6 μL E-Gel 1 Kb Plus Express DNA Ladder
    • 轻轻混匀并短暂离心
  3. 样品稀释用于电泳
    • 取酶切反应液：1 μL
    • 加入无核酸酶水：79 μL
    • 总体积：80 μL
    • 可选：根据需要加入 Invitrogen™ E-Gel™ Sample Loading Buffer 至 0.1X 终浓度，有助于上样可视化和下沉。
  4. 上样与电泳
    1. 将配制好的 DNA 梯度和样品各取 20 μL，加至 E-Gel 预制凝胶相应孔位。
    2. 在 E-Gel Power Snap Plus Electrophoresis System 上选择配套运行程序（针对 E-Gel EX 凝胶的预设方法），启动电泳。
    3. 电泳完成后使用内置的 Power Snap Plus 相机进行成像。

三、结果可视化与对比

采用 FastDigest 酶与 E-Gel Power Snap Plus 系统所得 DNA 条带分辨率与传统方法相当，酶切完全度良好，仍能提供清晰可靠的片段分离效果。区别在于：

  • 整体实验时间明显缩短
  • 操作环节更少、更标准化
  • 成像步骤被集成到同一系统中，便于数据保存与比较

应用场景与推荐产品

适用的分子克隆与 DNA 操作

FastDigest 限制性内切酶家族覆盖常用位点及多种 IIs 类酶，适用于：

  • 经典限制性克隆（载体线性化与插入片段准备）
  • 使用 IIs 类酶的模块化组装和 Golden Gate 组装
  • 质粒构建验证、酶切图谱确认
  • 各类常规 DNA 质控与片段分析

文中示例中使用的部分代表性产品如下（节选）：

  • FastDigest Value Pack（K1991）
  • E-Gel EX Agarose Gels, 1%（G401001）
  • E-Gel 1 Kb Plus Express DNA Ladder（10488091）
  • E-Gel Sample Loading Buffer, 1X（10482055）
  • E-Gel Power Snap Plus Electrophoresis System（G9301, G9311）
  • 部分 FastDigest 限制性内切酶（例如 DpnI、Esp3I、BamHI、EcoRI、NotI、XhoI、KpnI、PacI 等，均提供对应货号以便订购）

方案优势亮点

  • 显著节省时间与人力
    • 总耗时从约 3 小时 49 分缩短至 37 分钟
    • 动手时间减少超过一半，更适合批量样品处理
  • 统一缓冲体系，简化方法开发
    • 所有 FastDigest 限制性内切酶均在同一 10X FastDigest Buffer 中快速消化
    • 无需针对不同酶反复优化缓冲条件
  • 安全性与样本完整性提升
    • 使用 SYBR Safe 等兼容染料的预制 E-Gel 凝胶，无需溴化乙锭
    • E-Gel Power Snap Plus 不依赖开放式强紫外灯，减少对 DNA 和操作者的损伤
  • 结果标准化、易于记录
    • 电泳运行和成像在同一平台完成，减少人为差异
    • 可快速导出图像文件，用于实验记录、报告和发表
  • 兼容多种常规和高级克隆策略
    • 丰富的 FastDigest 酶种类（包括多种 IIs 类酶）支持复杂 DNA 组装策略
    • 适合从日常质粒线性化到高级模块化克隆的多种应用需求

小结

FastDigest 限制性内切酶与 Invitrogen E-Gel Power Snap Plus 电泳系统形成了一套从酶切到电泳分析的一体化解决方案。在保证酶切完全度与条带分辨率的前提下，该方案大幅缩短了实验总时间，显著减少了有毒化学品和紫外曝光的使用，并通过统一缓冲和预设程序提升了实验重复性和可操作性。

 

对于需要高通量构建、快速决策或强调实验室安全性的分子克隆实验室而言，这是值得优先考虑的载体制备与分析工作流。