前言

治疗性肽近年来受到广泛关注，并越来越多地被开发用于治疗各种疾病。它们的氨基酸序列及修饰经过专门设计，分子量通常在500 至 5,000 Da 之间。目前，全球有超过 100 种肽类药物被批准用于治疗各种疾病。最畅销且著名的合成肽药物是司美格鲁肽，一种由32 个氨基酸组成的胰高血糖素样肽-1（glucagon-like peptide-1, GLP-1）受体激动剂，用于治疗 2 型糖尿病和长期体重管理。自 2017 年被美国食品药品监督管理局（FDA）批准以来，含司美格鲁肽的制剂在 2024 年成为全球第三大畅销药物。

在本应用方案中，为全面覆盖生产、运输和储存过程中可能产生的潜在杂质，研究人员对司美格鲁肽样品进行了加热和氧化强制降解，以促进潜在杂质的生成。强制降解结束后，使用 Thermo Scientific™ Vanquish™ Flex UHPLC 系统与 Thermo Scientific™ Orbitrap™ Exploris™ 240 质谱仪联用进行司美格鲁肽降解产物及潜在杂质分析 （图1）。

 

图1. 司美格鲁肽降解产物鉴定实验研究流程

方案亮点

亮点1

使用Thermo Scientific™ Hypersil GOLD™ Peptide 分析色谱柱，仅使用甲酸（formic acid, FA）作为流动相添加剂，也可实现对司美格鲁肽及其降解产物的有效分离。

在常规的反相液相色谱多肽分析方法中，为了改善色谱峰形及提高分离度，通常使用三氟乙酸（trifluoroacetic acid, TFA）作为流动相添加剂，然而TFA会对质谱造成较强的离子抑制效应，故在液质联用实验中，甲酸是最常用的流动相添加剂，但其抑制非特异性相互作用的效果较差，与肽段形成的疏水性离子对也较弱。在本研究中，我们开发了基于Hypersil GOLD Peptide 分析色谱柱的司美格鲁肽液质联用分析方法，仅使用甲酸作为流动相添加剂的同时，也能实现司美格鲁肽及其杂质较好的分离效果（图2）。

 

图2. 司美格鲁肽对照样品、加热强制降解样品和氧化强制降解样品在280nm波长下的UV色谱图。TDP：司美格鲁肽加热强制降解产物，ODP：司美格鲁肽氧化强制降解产物。

亮点2

Orbitrap Exploris 240 二合一超高分辨质谱仪具有超高灵敏度，可实现低至0.005%水平的司美格鲁肽降解产物的可靠且灵敏的鉴定。

使用Vanquish Flex-Orbitrap Exploris 240液质联用平台分别对司美格鲁肽对照样品、加热强制降解样品和氧化强制降解样品进行数据依赖性质谱二级扫描（ddMS2），可对司美格鲁肽全长产品（full length product, FLP）、杂质（存在于对照样品中）和降解产物（由强制降解诱导产生）进行可信的检测与鉴定。表 1 列出了相对丰度超过司美格鲁肽 FLP 0.005%的所有降解产物（由强制降解样品产生）和杂质（存在于对照样品中），均由高质量二级谱图检测及鉴定得到。图3展示了杂质（T5缺失）肽段的二级谱图和二级碎片覆盖率，放大区域可见证明氨基酸缺失区域的b/y离子。该杂质在对照样品中的相对丰度仅为0.43%，证明了Orbitrap超高分辨质谱优异的灵敏度，为低丰度肽段的鉴定提供可信结果。

表1. 基于 UHPLC-HRAM MS 的司美格鲁肽及其降解产物的鉴定和相对定量结果。该表使用由 Ardia 平台支持的 Biopharma Finder 软件的报告功能生成，包括所有相对丰度高于 0.005% 的强制降解产物和存在于对照样品中的杂质。所有列出的结果在 Biopharma Finder 软件中均满足一级质量偏差小于 6 ppm 和 100 的置信度得分。

图3. 杂质（T5缺失）肽段的二级谱图和二级碎片覆盖率图。

亮点3

高质量的 HRAM 数据依赖性质谱二级扫描（ddMS2）数据能够对共洗脱杂质（包括痕量水平的同量异位素杂质）进行准确可靠的鉴定。

Orbitrap HRAM MS 平台的高分辨率、高灵敏度和高质量精度能够助力用户可靠地鉴定与司美格鲁肽 FLP主峰共洗脱的痕量同质组分。如图4所示，在对照样品（ 数据未显示）和加热强制降解样品中，通过高质量的一级及二级数据，鉴定到34.16 分钟与司美格鲁肽FLP主峰共洗脱的司美格鲁肽 A2 缺失杂质，相对丰度仅为 0.022%，该 A2 缺失肽段的理论单同位素质量为 4026.0632 Da。同样，在氧化强制降解样品中，通过高质量的一级和二级数据， 鉴定到了司美格鲁肽T5 缺失并在W24 位点发生单氧化的杂质降解产物，由于羟基在色氨酸侧链芳香环上的不同位置，导致色氨酸氧化会在反相色谱上产生多个不同保留时间的色谱峰，故该 T5 缺失 + W24 氧化肽段在31.94~40.07 分钟有多个色谱峰被洗脱，包括一个在34.17分钟处与主峰共洗脱的峰。该杂质理论单同位素质量为 4026.0626 Da，与前述A2 缺失杂质的理论单同位素质量仅差0.0006 Da （0.14ppm）。由于A2缺失杂质来源于司美格鲁肽样品本身，故在氧化强制降解样品中，该杂质会同司美格鲁肽FLP主峰和氧化诱导的司美格鲁肽T5 缺失并在W24 位点发生单氧化的杂质降解产物共洗脱，如图4第二行所示，其 MS2 谱图包含了与 A2 缺失（ 图4第一行用蓝色标注的 b/y 离子）和 T5 缺失+W24 氧化（图4第三行用紫色标注的 b/y 离子）肽段均匹配的特征离子，证实了在氧化降解样品中同时存在这两种同量异位素肽杂质并与司美格鲁肽主峰共洗脱。这两种共洗脱的同量异位素肽杂质在氧化强制降解样品中的总相对丰度为 0.022%。每种同量异位素肽的部分丰度通过前 3 个特征MS2 离子计算。通过这种方法，确定 A2 缺失杂质的相对丰度为 0.015%，而 T5 缺失 + W24 氧化的相对丰度为 0.007%。这个例子生动的展示了高质量的 HRAM MS数据对痕量同质异位素肽段，在色谱共洗脱的情况下，能够助力实现不同杂质的精确定性及相对定量。

图4. 氧化强制降解样品中 34.17 分钟低丰度共洗脱同量异位素肽杂质的鉴定。（A）来自加热强制降解样品（上图）和氧化强制降解样品（下图）的m/z 1008.0245（4+）的 XIC（±10 ppm 离子提取窗口）。（B）加热强制降解样品中 34.16 分钟洗脱的肽段（上图）、氧化强制降解样品中34.17 分钟洗脱的肽段（中图）和 31.94 分钟洗脱的肽段（下图）的高质量 MS2 谱图。（C）MS2 谱图局部放大（m/z 200–550）。（D）MS2 谱图局部放大（m/z1230–1400）。来自 A2 缺失杂质的特征 b/y 离子用蓝色标注。来自 T5 缺失 + W24 氧化降解产物的特征 b/y 离子用紫色标注。

结语：

使用 Vanquish Flex UHPLC 系统、Hypersil GOLD Peptide 分析色谱柱、Orbitrap Exploris 240 质谱仪并结合 BioPharma Finder 软件，可对加热强制降解和氧化强制降解的司美格鲁肽样品中的降解产物进行可靠鉴定，特别是对低丰度和共洗脱的同量异位素杂质，能够助力客户的日常研究。