前言

抗体-药物偶联物（antibody-drug conjugates, ADC）作为一类治疗癌症和自身免疫性疾病的生物医药类产品，近年来受到广泛关注。ADC通常由单克隆抗体（monoclonal antibody, mAb）通过可降解/不可降解的连接子（linker）与小分子药物（drug）共价偶联，这样的设计确保ADC可通过单抗精确识别靶细胞后，进入靶细胞并在胞内裂解释放小分子药物，从而实现精确杀伤靶细胞的目的。与单抗产品相同，电荷异质性也是ADC的关键质量属性之一，会对其质量、安全性、稳定性和效价等造成影响，故监管机构也对ADC的电荷异质性表征提出了要求，作为ADC质量控制的一部分。由于ADC结构的高度异质性，除单抗本身的修饰等带来的电荷异质性以外，连接子、小分子药物等均有可能引入新的电荷异质性，这使得ADC的电荷异质性分析颇具挑战性。

在本文的研究中，我们开发了基于在线多中心切割的2D UHPLC – native intact MS ADC电荷异构体分析方案，对市售的半胱氨酸偶联ADC Polivy® 的电荷异质体进行了分析。第一维的分离采用强阳离子交换色谱 （strong cation exchange， SCX），第二维使用体积排阻色谱（size exclusion chromatography, SEC ）并使用与质谱可以兼容的醋酸铵缓冲体系，确保半胱氨酸偶联ADC的链间非共价结合不会被破坏，能够保持完整状态进行质谱分子量分析，并测定其药物-抗体比率 (Drug-antibody ratio, DAR)等关键质量属性。Thermo Scientific™ Vanquish™ Online 2D-LC 系统与 Orbitrap™ Exploris™ 240 BioPharma超高分辨二合一质谱仪被用于分析，整体工作流程见图1。

图1. SCX-SEC-native intact MS 用于半胱氨酸偶联ADC 工作流程示意图。

方案亮点

亮点1

Thermo Scientific™ ProPac™ 3R SCX 色谱柱与CX-1™ pH 梯度缓冲液配合使用，可在第一维色谱上对ADC电荷异构体进行有效分离。

本研究中第一维分离使用ProPac 3R SCX 色谱柱，该色谱柱采用3µm单分散填料，能够对ADC的电荷异构体实现更好分离。CX-1™ pH 梯度缓冲液可以建立线性pH梯度，使用方便，重现性好，二者配合使用可在第一维强阳离子交换色谱上对Polivy的电荷异构体实现良好分离 （图2）。

图2. ¹D SCX (上) 与 ²D SEC （下） UV 谱图，SEC谱图为三个不同馏分（105 μL ¹D洗脱液），证明了反冲（黑色）与正冲（粉色）相比，可显著改善²D SEC的峰型并提高其灵敏度。

亮点2

第二维反冲（backflush）及多中心切割可改善二维SEC峰型，提高其灵敏度，醋酸铵体系的使用可以实现与质谱的在线直连。

由于一维的SCX缓冲液体系中含有大量与质谱不兼容的缓冲盐，故二维的SEC就显得必不可少，可以在除去一维体系中缓冲盐的同时，使半胱氨酸偶联ADC保持近天然状态，被送入质谱进行在线完整分子量测定。二维色谱的流路连接如图3，第一维分离后的馏分按设置好的时间窗口被依次收集至样品环中，其流路设计确保每个馏分以反冲的方式从样品环中被送入二维色谱柱，可以改善二维SEC的峰型并提高其灵敏度（图2/3）。

图3. 多中心切割2D-LC-HRAM MS 系统流路图，(A) 反冲， (B) 正冲。收集一维馏分的样品环体积为250 μL。

亮点3

Orbitrap Exploris 240 BioPharma 超高分辨二合一质谱仪可在非变性条件下对半胱氨酸偶联ADC进行完整分子量测定，其高灵敏度有助于低丰度组分的准确鉴定。

在本文的研究中，第一维SCX分离总共鉴定到18个色谱峰（图4），将18个峰按保留时间分为4组，每针进样依次收集一组峰并送至质谱进行在线完整分子量分析，每个峰仅收集一次。得益于Orbitrap质谱的超高灵敏度，即使是相对丰度仅有0.43%的18号峰也可通过单次收集进行高分辨质谱的在线分析。

图4. ¹D SCX UV谱图，总共分离并鉴定到了18个色谱峰。下方的表格展示了每个峰的相对丰度及转移至2D SEC的每个馏分的体积。

图5展示了8号及9号两个相对丰度最高的峰非变性质谱完整分子量测定的结果。从图中可以发现，8号峰主要以偶联两个药物的相关组分为主，9号峰主要以偶联四个药物的相关组分为主，说明偶联药物数目会对ADC的电荷异质性造成影响。

图5. 图4中8号峰及9号峰的一级质谱图及解卷积结果。左，m/z=5000~7000Da，一级质谱图。中，左图红色阴影区域放大，可见不同组分的质谱峰分布。右，解卷积结果。

对质谱结果进一步分析发现，单抗本身的修饰，如重链末端赖氨酸丢失、脱酰胺和氧化等也会对ADC电荷异质性造成影响。以11号峰和12号峰为例，11号峰中主要组分为D2+1Lys与D4+0Lys，12号峰中主要组分为D4+1Lys与D6+0Lys （图6），在其他峰中也可观察到类似的Dn+1Lys与Dn+1+0Lys分布模式，进一步证明了ADC电荷异构体的高度复杂性和使用超高分辨质谱对ADC电荷异构体进行分析的必要性。

图6. 图4中11号峰及12号峰的一级质谱图及解卷积结果。左，m/z=5000~7000Da，一级质谱图。中，左图红色阴影区域放大，可见不同组分的质谱峰分布。右，解卷积结果，可见赖氨酸变体导致的Dn+1Lys与Dn+1+0Lys分布模式。

如前文所述，即使是相对丰度只有0.43%的18号峰，得益于质谱平台的高灵敏度，单针进样并分离的18号峰仍然能够得到高信噪比的质谱数据，从而实现蛋白分子量的准确鉴定。如图7所示，该峰中主要包括D4、D6及D6和D8的赖氨酸变体，再次证明了前端分离技术和质谱平台的灵敏度、分辨率及质量精度对痕量ADC电荷异构体鉴定的必要性。

图7. 18号峰的 ¹D UV谱图（上）及 ²D质谱图和解卷积谱图（下）。

图8总结了¹D SCX分离后各个色谱峰中由质谱所鉴定到的主要组分，可见药物偶联数目及抗体本身的翻译后修饰均会对ADC的电荷异质性产生影响。

图8. ¹D SCX分离的各个色谱峰中主要成分汇总（左表）。脱酰胺和氧化多于酸性峰中被鉴定到，赖氨酸变体多见于碱性峰中。随偶联药物数目的增加，ADC在SCX柱上的保留时间也相应增加。

结语：

本文开发了一种基于在线多中心切割的SCX-SEC-native intact MS 半胱氨酸偶联ADC电荷异构体分析方案，将其应用于半胱氨酸偶联ADC Polivy的电荷异质体分析中，并能得到良好结果。ProPac 3R SCX 色谱柱与CX-1 pH 梯度缓冲液配合使用，可实现ADC电荷异构体在第一维色谱上的有效分离，反冲能够改善第二维SEC的色谱峰型并提高灵敏度，Orbitrap Exploris 240 BioPharma二合一超高分辨质谱仪能够对ADC的各个异构体组分进行鉴定，包括痕量组分。该平台普适性强，可对不同mAb/BsAb/ADC等生物分子进行电荷异质性分析。