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细胞“迷路”了怎么办？EasySCP首次让单细胞蛋白组拥有空间坐标
当组织被解离成单个细胞，我们获得了细胞身份，却丢失了它原本所在的位置。如今，单细胞蛋白质组学正尝试把这块“拼图”重新找回来。从“认识细胞”到“理解细胞”，我们还缺少什么？发表于Nature Communications的最新研究《EasySCP unveils extensive liver zonation at single-cell proteomics resolution》，正是围绕这一问题，并基于单细胞蛋白质组学技术徐徐展开。
单细胞蛋白质组学虽然已经取得了快速发展，但真正进入更多实验室仍然面临一个现实挑战——样品制备。相比传统蛋白质组学实验，单细胞样品量极低，对每一步操作都提出了更高要求。研究人员不仅需要完成单细胞分选，还要在纳升级甚至更小体积内完成细胞裂解、蛋白酶解和样品处理。任何一次液体转移、任何一次吸附损失，都可能导致最终检测失败。因此，目前不少单细胞蛋白质组学流程仍然依赖专用芯片、微流控系统或复杂的自动化设备，虽然检测能力不断提高，但实验门槛也随之增加。
如果一种技术能够做到：不依赖复杂微流控平台，使用常规实验室即可完成样品制备；且尽可能减少样品损失的同时保持较高的检测深度和良好的重复性，那么，它就有机会真正推动单细胞蛋白质组学走向更广泛的应用。本文要介绍的EasySCP正是在这样的背景下诞生。
EasySCP：把复杂流程，变成“一锅完成”
EasySCP（Easy Single-Cell Proteomics）是重新设计了整个单细胞样品制备流程。研究团队采用了目前实验室普遍具备的流式细胞分选（FACS）技术，将单个细胞直接分选至预先完成试剂铺板的384孔板中。具体来说，即将蛋白质组学裂解细胞及酶切等操作所需的质谱及蛋白酶兼容的去垢剂、蛋白酶以及质谱可挥发的缓冲盐预先铺板，而后FACS技术基于细胞大小尺寸、荧光标记等将细胞分选入孔内，与预先铺板的SuperMix裂解液进行反应，无需反复转移样品。整个流程遵循类似于“One-pot（一锅法）”设计理念，使所有关键反应均在同一反应体系中完成，大幅减少了超微量样品在操作过程中的损失。与此同时，研究团队利用PCR仪热盖维持稳定温度，在保证酶解效率的同时有效降低反应液蒸发，使整个实验流程更加稳定，也更容易在不同实验室之间实现重复。相比需要复杂微流控装置或定制芯片的平台，这种设计更加贴近日常实验室的操作习惯，也降低了单细胞蛋白质组学技术的应用门槛。更重要的是，EasySCP并没有因为流程简化而牺牲检测性能。作者在接下来的实验结果证明，这套流程不仅操作更加简洁，而且依然能够实现高深度、高重复性的单细胞蛋白质组检测，为后续开展复杂组织和空间生物学研究奠定了可靠基础。
从"能做"到"做好"：EasySCP如何证明自己的实力？
一种新的单细胞蛋白质组学方法，要真正获得研究人员认可，仅有简化的实验流程还远远不够。我想，对于科研工作者而言，更关心的是三个问题：
它测得够深吗？
数据稳定吗？
面对真实复杂样本还能不能保持同样的表现？
围绕这三个问题，研究团队设计了一系列层层递进的验证实验。从标准细胞系到复杂肿瘤组织，再到最终的肝脏空间重建，每一步都在回答同一个问题——EasySCP究竟是否具备成为一种通用单细胞蛋白质组学方法的潜力？
在标准细胞中，它能测到多少蛋白？
任何一种新的蛋白质组学方法，首先都需要在标准样本中验证检测性能。研究团队选择了人胚肾细胞系 HEK293 作为模型，对EasySCP流程进行了系统评估。依托EasySCP样品制备流程，在24分钟液相梯度条件下，即可实现超过7200种蛋白和50000余条肽段的鉴定深度，技术重复之间也表现出良好的一致性。如此高的覆盖深度，说明EasySCP不仅能够满足单细胞蛋白质
图2 EasySCP在标准细胞模型中实现高深度蛋白鉴定，并保持优异的技术重复性。
真正进入单细胞，性能还能保持吗？
标准样本只能说明方法可行，而真正具有挑战性的，是单个细胞。单细胞样本意味着极低的蛋白起始量，也意味着任何微小的实验误差都会被无限放大。因此，研究团队进一步优化了反应体系体积和酶解条件，对真实单细胞进行了检测。
结果显示，在单个细胞中，EasySCP依然能够稳定鉴定4200余种蛋白；当样本量增加至20个细胞时，可鉴定蛋白数量进一步提升至6500种以上（采用MBR分析策略）。与此同时，空白对照仅检测到少量蛋白信号，说明整个实验体系具有较低背景干扰，数据来源可靠，而非环境污染或交叉污染造成的假阳性结果，
这说明EasySCP在灵敏度和背景控制之间取得了良好的平衡。
面对复杂组织，它还能保持稳定表现吗？
实验室培养细胞虽然便于评价技术性能，但距离真实生物学问题还有一定距离。真正复杂的是组织样本。在组织中，不同类型细胞混杂共存，细胞大小、蛋白丰度和代谢状态都存在显著差异，这也是单细胞蛋白质组学最具挑战性的应用场景之一。
为了进一步验证EasySCP的适用范围，研究团队将其应用于MC38小鼠结直肠癌模型。实验首先通过CD45标记将肿瘤组织中的免疫细胞与非免疫细胞进行区分，再分别开展单细胞蛋白质组学分析。结果显示，免疫细胞中可得到中位数3200+蛋白和12000+肽段鉴定，而非免疫细胞中则可得到3500+蛋白以及14000+肽段的鉴定；而且不同细胞群之间形成了清晰的蛋白表达谱差异。这说明，仅依据蛋白质表达信息，就能够准确区分免疫细胞和肿瘤相关细胞，并呈现出符合生物学规律的功能富集结果。
这一结果说明，EasySCP不仅适用于标准细胞系，同样能够胜任复杂组织微环境中的单细胞分析，为后续研究肿瘤免疫、组织异质性等问题提供了可靠工具。
图3 EasySCP不仅适用于标准细胞，也能够稳定应用于真实单细胞及复杂肿瘤组织
真正的突破，并不只是"测得更多"
这项工作它让研究团队首次具备了在大规模单细胞蛋白质组数据基础上，重新思考一个长期困扰空间生物学的问题：
如果组织已经被完全解离，我们还能不能仅凭蛋白质表达谱，推断每一个细胞原本位于组织中的哪个位置？
对于大多数器官来说，这或许只是一个有趣的科学设想。但对于具有明确空间分区特征的肝脏而言，这个问题意味着另一种可能——蛋白质表达是否能够成为重建组织空间结构的新依据？正是在这一思路推动下，EasySCP开始从一项样品制备技术，迈向了这篇论文真正的科学核心：单细胞蛋白质组学分辨率下的肝脏空间重建。
从"看到蛋白"到"找回位置"：单细胞蛋白质组学如何重建肝脏空间图谱？
当组织已经被完全解离，每一个细胞还能不能"记得"自己来自哪里？
过去，空间信息几乎完全依赖组织切片。无论是空间转录组、空间蛋白组，还是激光显微切割（LCM）结合质谱分析，都需要在组织保持完整结构的前提下进行检测。一旦组织被消化、细胞被分离，原有的空间关系便随之消失。因此，在传统单细胞研究中，我们通常能够回答两个问题：
这是什么细胞？
它表达了哪些分子？
却很难回答第三个问题：它原本位于组织中的哪里？
而对于肝脏而言，这恰恰是理解其生物学功能最重要的信息之一。
肝脏为什么如此依赖"空间"？
很多人认为，肝细胞都是一样的。事实上并非如此。从门静脉（Portal Vein，PV）到中央静脉（Central Vein，CV），肝细胞形成了一条连续变化的功能梯度，这种现象被称为肝脏空间分区（Liver Zonation）。可以把它理解成一条不断变化的"功能坐标轴"。位于门静脉附近的肝细胞，更倾向于承担基础代谢任务，例如糖异生、尿素循环以及脂肪酸氧化等过程；而靠近中央静脉的肝细胞，则主要负责糖酵解、脂质合成以及药物代谢等功能。虽然这些细胞在显微镜下看起来几乎没有区别，但它们表达的蛋白质和执行的生物学功能却截然不同。因此，对于肝脏来说，空间位置本身就是功能的一部分。
研究团队利用EasySCP分析了608个小鼠单个肝细胞，并结合流式细胞分选获得具有不同空间来源的细胞群体。即使不依赖组织切片，仅根据单细胞蛋白表达谱，不同区域来源的肝细胞依然能够形成连续而稳定的空间分布。研究人员进一步对5267个可定量蛋白进行了分析，发现其中约三分之二的蛋白呈现出明显的空间表达梯度。大量蛋白的表达水平会随着细胞从门静脉区域向中央静脉区域移动而发生规律性变化，而这种变化并非随机，而是与肝脏已知的功能分区高度一致。这些结果与既往基于空间蛋白组学和组织切片获得的认识相互印证，也进一步证明了EasySCP重建空间信息的可靠性。
这一结果说明，蛋白质表达不仅记录了细胞正在执行什么功能，也保留了细胞所处空间环境的信息。
图 4 第一次，在单细胞蛋白组水平"看见"肝脏空间分区
图5 对于肝脏而言，"位置"决定了细胞承担的生物学功能，且超过三分之二蛋白具有空间表达梯度
总结：
本研究亮点：
建立了基于384孔板的一锅法单细胞蛋白质组学流程EasySCP；
在真实单细胞中实现高深度、高重复性的蛋白质组检测；
首次在单细胞蛋白质组分辨率下重建肝脏空间分区；
提出Hepatocyte Spatial Status（HSS）空间评分体系；
证明蛋白质表达可作为细胞空间定位的重要信息来源。
研究团队介绍
本研究由郑州大学天健先进生物医学实验室联合以色列魏茨曼科学研究所（Weizmann Institute of Science）、北京大学现代农业研究院等单位共同完成，是我国科研团队与国际研究机构在单细胞蛋白质组学领域开展合作取得的重要成果。
第一作者及通讯作者 | 郝兵兵 副研究员
郝兵兵博士（Bingbing Hao）现任郑州大学天健先进生物医学实验室副研究员，长期从事单细胞蛋白质组学方法开发及其生物医学应用研究，是EasySCP技术的主要研发者之一。
通讯作者 | 李保国 教授
李保国教授现任郑州大学天健先进生物医学实验室相关研究团队负责人，长期致力于代谢性疾病、蛋白质组学及单细胞组学技术的研究。
通讯作者 | Ido Amit 教授
Ido Amit教授现任以色列魏茨曼科学研究所（Weizmann Institute of Science）免疫学系教授，是国际单细胞组学领域的重要学者之一。
通讯作者 | 秦国臣 研究员
秦国臣研究员现任北京大学现代农业研究院质谱分析（蛋白质组与代谢组）平台主任、作物质谱分析与分子育种课题组负责人，长期从事高分辨率质谱分析技术、蛋白质组学方法开发及其生物学应用研究。
写在最后：
从"测得更多"到"看得更深"：高性能质谱平台如何推动单细胞蛋白质组学迈向空间生物学？
如果把EasySCP比作一套更加高效、更加普适的单细胞样品制备流程，那么真正支撑这项研究完成的另一块基石，则来自高性能质谱分析平台。
事实上，单细胞蛋白质组学的发展，一直受到两个关键因素的共同推动。一方面，是样品制备流程不断优化，使越来越少的蛋白损失在实验过程中；另一方面，则是质谱仪器不断突破检测灵敏度、扫描速度和定量稳定性的边界，让研究者能够从极其有限的样本中获取更多、更可靠的信息。两者缺一不可。
EasySCP能够在单细胞水平获得数千种蛋白的稳定鉴定，并进一步开展空间重建分析，正是建立在样品制备与质谱检测协同优化的基础之上。一个哺乳动物细胞内蛋白总量通常只有皮克（pg）级别，相比常规蛋白质组学实验，起始样品量降低了数百万倍。这意味着，每一次离子利用效率的提升、每一次扫描速度的优化、每一次定量稳定性的改善，都可能直接影响最终能够鉴定到多少蛋白，以及这些蛋白是否能够真实反映细胞状态。
本研究中，EasySCP流程获得的样品最终通过 Thermo Scientific™ Orbitrap Astral™ 质谱平台完成采集，并结合 Vanquish™ Neo 纳升级液相系统进行分析。对于单细胞蛋白质组学而言，这套平台的价值不仅体现在更高的蛋白鉴定数量，更重要的是能够在极低样品起始量条件下保持高灵敏度、高扫描速度和稳定的定量表现。从这个角度来看，Orbitrap Astral™不仅是一台性能优异的质谱仪，更是推动单细胞蛋白质组学从"深度检测"走向"空间解析"的重要技术支撑。
展望：从"测得更深"迈向"测得更多"
随着越来越多研究开始关注组织异质性、疾病进程以及细胞命运演变等复杂生物学问题，单细胞蛋白质组学正在面临新的挑战——如何进一步提升实验通量。
目前，大多数单细胞蛋白质组学工作流程仍采用单细胞逐个上机分析的模式。尽管近年来仪器灵敏度和扫描速度不断提升，但在开展数千甚至数万个细胞的大规模研究时，质谱采集时间依然是影响实验效率的重要因素。因此，多重同位素标记（Multiplexing）正逐渐成为单细胞蛋白质组学的重要发展方向。
其中，基于 Tandem Mass Tag（TMT） 的多重标记策略，在一次LC-MS/MS采集中同步完成多个样本的定量，从而显著提升样本分析效率，并有效降低批次效应。并且随着标记化学和质谱检测能力的不断提升，更高plex数的TMT试剂正在进一步拓展单细胞蛋白质组学的通量边界。如新一代 TMT 32plex &35plex有望在保持高定量准确性的同时，实现更多单细胞样本的同步分析，为大规模细胞图谱绘制、疾病队列研究以及空间生物学研究提供更高效的数据获取能力。
目前，赛默飞也正在开发基于TMT标记的高通量单细胞蛋白质组学工作流程，希望结合高效样品制备策略与新一代高plex多重标记技术，进一步提升单细胞蛋白质组学的检测通量和实验效率，助力更大规模、更高分辨率的生物学研究。
从EasySCP降低单细胞样品制备门槛，到Orbitrap Astral™&Orbitrap Astral Zoom平台持续提升检测深度，再到TMT等高plex多重标记策略不断突破实验通量，单细胞蛋白质组学正逐步构建起覆盖样品制备—高灵敏度检测—高通量定量的完整技术体系。随着这些关键技术不断成熟，研究者将能够以前所未有的深度和规模解析复杂组织中的细胞异质性，为空间生物学、疾病机制研究以及精准医学带来更多可能。