生物大分子三维结构解析是结构生物学的核心，传统技术受限于表征难度、灵敏度等瓶颈。Thermo Scientific™ Orbitrap™ Ascend Editions三合一质谱仪凭借多种碎裂/活化技术与可选配的Native MS 选项，为蛋白质结构生物学研究提供强力支撑。

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赛默飞Orbitrap™ Ascend Editions三合一质谱仪

赛默飞Orbitrap Ascend Editions质谱仪多种碎裂/活化技术，精准解构分子细节

赛默飞Orbitrap Ascend Editions 质谱仪集成六种正交碎裂方式（CID、HCD、ETD、EThcD、ETciD、UVPD）和PTCR活化方式，且不同碎裂/活化方式之间可灵活组合，实现从肽段到完整蛋白的全方位结构解析。

赛默飞Orbitrap Ascend Editions中的多种碎裂/活化方式
Orbitrap Ascend Editions 中的多种碎裂/活化方式

1. 经典碎裂技术：高效获取基础信息

CID，HCD 适用于常规肽段序列解析，其中HCD碎裂获取更丰富信息，精准定位N糖基化、磷酸化等翻译后修饰（PTM）位点。

2. 电子转移碎裂技术：适配复杂修饰场景

ETD可保留糖链等修饰信息，适用于O糖基化等特定修饰分析；可一定程度打开二硫键，结合三级分析可定位复杂二硫键位点；可特异性区分亮氨酸和异亮氨酸，提高从头测序分析的精准性；可降低氢氘重排，在HDX分析中提高蛋白蛋白结合位点的分析精度；相比经典碎裂技术，更适合完整蛋白Top-down或者Middle-down分析，获得更高的序列覆盖度。此外，衍生的EThcD、ETciD可进一步提高ETD谱图的质量。

3. 紫外光解离技术：突破传统碎裂局限

UVPD可断裂更多类型化学键，获得丰富的各类碎片离子，在Top-down分析中可作为正交碎裂方式使用。

4. PTCR技术：简化复杂谱图

PTCR可在一级或多级后插入，通过质子转移，电荷减少，可有效简化复杂谱图，提高一级解析成分的数目，提高二级或多级谱图解析的覆盖度。

5. 多种碎裂/活化协同：实现深度解析

上述多种不同的碎裂/活化方式可按需进行搭配组合，例如HCDpdETD，HCDpdUVPD可用于未富集糖肽的解析；HCD，ETD，UVPD，PTCR组合可用于提高完整蛋白 Top-down和Middle-down的序列覆盖度。此外，Orbitrap Ascend Editions质谱仪温和的离子源区设计，可保留不稳定及低丰度修饰，以及其双多极离子通道的设计，实现多流程同步，使其更适配于多种翻译后修饰分析及 Top-down 蛋白质组学分析。

Native MS 选项，还原天然结构本貌

非变性质谱是表征生物大分子天然构象的核心技术，赛默飞Orbitrap Ascend Editions质谱仪可选的Native MS 选项，将Orbitrap检测上限提至16,000 m/z，可高效检测数百kDa级复合物（如800 kDa的GroEL蛋白），也可用于膜蛋白分析。四极杆隔离范围扩展至8,000 m/z，在进行大蛋白及复合物分析中，可选用四极杆替代离子阱进行离子隔离。

Native MS 选项扩展质量范围及隔离范围
Native MS 选项扩展质量范围及隔离范围

赛默飞Orbitrap Ascend Editions质谱分析仪应用实例

01 结合 Native MS 与 DIA-PTCR解析膜蛋白结构

膜蛋白积极参与细胞过程，大约占60% 的临床药物靶点，具有极高的研究价值。用于溶解膜蛋白的膜模拟物结构复杂，给非变性质谱分析带来困难。常见的膜模拟物包括去污剂胶束、纳米盘（nanodiscs）和苯乙烯马来酸脂质颗粒（SMALPs），可维持膜蛋白的原生结构。

不同类型的膜模拟物
不同类型的膜模拟物

对nanodisc中膜蛋白进行 DIA-PTCR 分析（如分别针对 m/z 7000、7300、7600 的 PTCR 扫描），可分辨电荷价态，发现全扫描中隐藏的多个峰，提升分析准确性。对 DIA-PTCR 谱图进行滑动窗口解卷积，得到 140-175 kDa 的分子量，相邻解卷积峰间距为 700-750 Da，符合脂质的分子量范围，为 nanodisc中膜蛋白 - 脂质复合物的组成分析提供依据[1]。

Nanodisc中膜蛋白的DIA-PTCR 谱图及解卷积结果
Nanodisc中膜蛋白的DIA-PTCR 谱图及解卷积结果

02 结合多种碎裂/活化方式定位ADC药物中的Payload

抗体药物偶联物（ADCs）通过 linker 将单克隆抗体（mAb）与细胞毒性药物（payload）共价结合，兼具抗体的靶向特异性和药物的高杀伤活性，用于癌症等疾病治疗，但偶联会导致 DAR 异质性（药物分子数量可变）和结合位点异质性（偶联位置不同），影响产品安全性和疗效。

传统方法表征 payload结合位点时，Bottom-up易产生人工修饰，无法反映天然状态；Top-down序列覆盖率低；Middle-down虽可分析～25 kDa 亚基，但 MS² 实验中碎片离子谱图拥挤复杂，导致 payload 结合位点无法明确鉴定。结合多种碎裂/活化方式可有效定位ADC药物中的payload [2]。

PTCR将原本集中在 800-1400 m/z 范围的碎片离子分散至 500-8000 m/z 区间，降低碎片离子谱图的复杂度，同时提升诊断离子的检测率和鉴定可信度。

Fd′+1a 的EThcd MS2和 EThcD MS2-PTCR MS3谱图对比
Fd′+1a 的EThcd MS2和 EThcD MS2-PTCR MS3谱图对比

不同碎裂方式结合PTCR可分别有效提高序列覆盖度。EThcD 与 PTCR 联用表现最优，Fd′ 各亚基覆盖率达 70.7%-72.0%，较不使用PTCR平均提升 17%。

不同碎裂方式结合PTCR前后的序列覆盖度及payload位点
不同碎裂方式结合PTCR前后的序列覆盖度及payload位点

此外，两种或多种碎裂/活化方式的结合，产生丰富的碎片形式，可明确亚基上的 payload 结合位点。

多种碎裂方式结合可明确payload的结合位点
多种碎裂方式结合可明确payload的结合位点

赛默飞Orbitrap Ascend Edition质谱分析仪重构结构生物学分析范式

赛默飞Orbitrap Ascend Edition 质谱仪以碎裂技术的灵活性与Native MS的天然构象保留能力为核心，为基础研究与药物研发提供高效精准支撑，成为推动结构生物学突破的重要工具。

赛默飞产品推荐

参考文献：

[1] Establishing a Decision Tree for Native Mass Spectrometry Analysis of Membrane Proteins in Complex Membrane Mimetics. Thermo PO2023-21EN

[2] Enhanced Payload Localization in Antibody−Drug Conjugates Using a Middle-Down Mass Spectrometry Approach with Proton Transfer Charge Reduction. Anal. Chem. 2024, 96, 18483−18490

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赛默飞Orbitrap Ascend Editions质谱仪常见问答
 

问：赛默飞Orbitrap Ascend Editions 如何提升结构生物学中的质谱分析能力？
答：传统大分子表征常受限于灵敏度和解析难度。Thermo Scientific™ Orbitrap Ascend Editions 质谱仪集成了六种正交碎裂方式（CID、HCD、ETD、EThcD、ETciD、UVPD）以及 PTCR 活化技术，并可选配 Native MS 选项。这种多种碎裂/活化技术的灵活组合，实现了从肽段到完整蛋白的全方位结构解析，为结构生物学研究提供了极具深度的质谱分析方案。

问：Native MS（非变性质谱）选项在检测大分子复合物时有哪些具体优势？
答：Native MS 是保留生物大分子天然构象的核心技术。赛默飞Orbitrap Ascend Editions 的 Native MS 选项将 Orbitrap 的检测上限大幅提升至 16,000 m/z，并将四极杆隔离范围扩展至 8,000 m/z。这使得仪器能够高效检测数百 kDa 级的超大复合物（例如 800 kDa 的 GroEL 蛋白），甚至在面对复杂的膜模拟物（如 nanodiscs）时，也能有效开展膜蛋白的非变性质谱分析。

问：在 ADC 药物的质谱分析中，如何利用Orbitrap Ascend Editions精准定位 Payload（细胞毒性药物）结合位点？
答：ADC 药物的 Middle-down 分析常面临 MS² 谱图极度拥挤的难题。赛默飞Orbitrap Ascend Editions质谱仪引入的 PTCR（质子转移电荷减少）技术能有效简化复杂谱图，将集中的碎片离子分散至 500-8000 m/z 区间。根据实际应用，将 EThcD 碎裂与 PTCR 联用，可使 ADC 亚基序列覆盖率提升约 17%（达 70.7%-72.0%），从而明确鉴定并定位亚基上的 Payload 结合位点，克服了传统质谱分析的局限。