Platinum II Taq Hot-Start DNA Polymerase 实现 4 kb 以内快速 PCR 扩增（≤40 分钟）

引言

聚合酶链式反应（PCR）是分子生物学中最基础且应用最广泛的技术之一，可用于基因分型、病原检测、基因表达分析及测序前的靶序列扩增等多种应用。然而，传统 PCR 往往需要 1 小时甚至更长时间才能完成一个扩增程序，影响实验通量与结果获取速度。

 

Invitrogen™ Platinum™ II Taq Hot-Start DNA Polymerase 结合快速循环程序，可在显著缩短运行时间的同时保持可靠的扩增效率和灵敏度。在本技术说明中，展示了该酶在 100 bp–4 kb 不同长度靶标上的快速端点 PCR 扩增性能：100 bp 片段可在约 21 分钟内完成扩增，4 kb 片段则可在约 38 分钟内完成，为需要快速获得 PCR 结果的科研应用提供有效解决方案。

应用背景：快速 PCR 与通用退火温度的需求

在高通量或时间敏感的项目中（例如临床相关研究样本的快速预筛、多个候选靶点的快速验证等），PCR 步骤往往成为整体流程的时间瓶颈。理想的快速 PCR 方案不仅要压缩循环时间，还需要在以下方面保持性能：

  • 扩增特异性与灵敏度
  • 不同模板类型（人基因组 DNA、细菌基因组 DNA、质粒 DNA 等）的兼容性
  • 对不同引物对的适应性及多反应共循环能力

Platinum II Taq Hot-Start DNA Polymerase 的配方和缓冲体系设计，使退火温度可统一设定为 60°C（只要引物遵循通用设计原则），从而支持多组 PCR 反应在同一次热循环中共循环，极大简化了实验条件优化与程序设置。

实验方法与结果

PCR 反应体系与材料

  1. 主要试剂与耗材
    • Invitrogen™ Platinum™ II Taq Hot-Start DNA Polymerase（Cat. No. 14966001）
    • Invitrogen™ dNTP Mix（10 mM each，Cat. No. 18427013）
    • Invitrogen™ Nuclease-Free Water（非 DEPC 处理，Cat. No. AM9938）
    • 正向与反向引物：按常规 PCR 引物设计原则合成
    • 模板 DNA：
      • pBR322 质粒 DNA
      • 大肠杆菌（E. coli）基因组 DNA
      • 人基因组 DNA
    • PCR 仪：Applied Biosystems™ ProFlex™ PCR System，3 × 32 孔模块（Cat. No. 4484073），升温速率设置为 6°C/s
  2. Amplicon 分析材料
    • Invitrogen™ E-Gel™ Sample Loading Buffer, 1X（Cat. No. 10482055）
    • Invitrogen™ E-Gel™ 1 Kb Plus Express DNA Ladder（Cat. No. 10488091）
    • Invitrogen™ E-Gel™ EX Agarose Gels, 2%（Cat. No. G401002），用于 ≤0.5 kb 片段
    • Invitrogen™ E-Gel™ EX Agarose Gels, 1%（Cat. No. G401001），用于 1–4 kb 片段
    • Invitrogen™ E-Gel™ Power Snap Plus Electrophoresis System（Cat. No. G9101）
  3. 推荐 20 µL 反应体系

建议在配制主反应混合液时，除模板外其他组分可按 n+1 的量统一预混，以减少移液误差和操作时间。

快速循环程序设置

在保持扩增特异性和产量的前提下，通过缩短各温度步骤时间实现快速 PCR。推荐的快速循环程序如下：

重要说明：

  • 得益于通用退火温度 60°C，多个不同靶标（如不同基因或不同模板来源）可以在同一 PCR 程序中共循环，有利于批量检测或多片段验证。
  • 建议将热循环仪升温/降温速率设置为 6°C/s，以进一步缩短总程序时间。

扩增性能评价：不同片段长度的快速扩增

使用上述反应体系和循环条件，从人基因组 DNA、E. coli 基因组 DNA 和 pBR322 质粒 DNA 中分别扩增 6 个不同长度的靶标：100 bp、250 bp、500 bp、1 kb、2 kb 和 4 kb。所有扩增产物经 E-Gel 琼脂糖凝胶电泳分析。

 

实验结果显示：

  • 六种长度的目标片段均获得清晰单一条带，表明快速循环条件下扩增特异性良好。
  • 与常规循环程序（未在图中展示）相比，快速程序的扩增产率具有可比性，未观察到明显下降。

扩增时间比较：快速程序显著缩短 PCR 总时间

为定量评估时间收益，对比了常规 PCR 循环程序与快速程序在不同片段长度下的总运行时间。

 

从图中可见：

  • 对 100 bp 靶标，快速程序总耗时约 21 分钟；对于 4 kb 靶标，总耗时约 38 分钟，均较标准程序缩短超过三分之一。
  • 考虑到总时间中约 14.5 分钟为仪器温度爬升时间，进一步优化升降温速率或使用更快的热循环平台有望进一步压缩总反应时间。

应用场景

在以下科研和生物技术应用中，Platinum II Taq Hot-Start DNA Polymerase 的快速扩增能力可显著提升流程效率：

  • 基因分型与突变检测
    在需分析大量样本或多个位点的项目中（如候选基因筛查、转基因鉴定等），可利用通用退火温度和多反应共循环能力，缩短每日 PCR 批次总时间。
  • 病原相关基础研究与快速预筛
    对细菌或病毒相关靶标进行快速 PCR 预筛，可为后续测序或功能验证提供及时信息（仅限科研用途）。
  • 测序前扩增与克隆构建
    1–4 kb 片段的快速扩增有助于提高构建载体或测序文库制备的通量，加快构建–验证循环。
  • 基因表达相关研究中的基因片段扩增
    在 RT-PCR 产物或 cDNA 模板基础上进行特定片段放大时，可在一天内完成多个靶标的扩增与电泳验证。
  • 多模板、多片段同时扩增
    利用统一的 60°C 退火温度，可将来自人基因组、细菌基因组及质粒等不同模板的反应放在同一程序中运行，简化实验排版与仪器使用。

产品优势亮点

  • 显著缩短 PCR 扩增时间
    采用优化循环程序后，100 bp–4 kb 靶标总反应时间约为 21–38 分钟，相比标准程序可节省超过三分之一的时间。
  • 通用退火温度 60°C，利于多反应共循环
    Platinum II PCR 缓冲液的配方设计，使绝大多数按常规原则设计的引物可在 60°C 退火，实现不同片段、不同模板的统一程序设置。
  • 高性能热启动技术
    采用高级别热启动机制，可在室温下配制反应体系，降低非特异性扩增和引物二聚体形成风险，并提升整体灵敏度。
  • 体系优化简便
    推荐反应体系已针对 Mg²⁺ 浓度和 dNTP 配比进行优化，用户仅需根据模板类型调整 DNA 投入量即可开始实验。
  • 与 E-Gel 电泳平台高度兼容
    面向不同片段长度提供 2% 与 1% E-Gel EX Agarose Gels，并搭配快速成像系统，使从扩增到结果判读的整体时间进一步缩短。
  • 适用模板类型广泛
    在人基因组 DNA、E. coli 基因组 DNA 及质粒 DNA 上均表现出稳定的扩增性能，有利于在多种模型系统中统一使用。

小结

本技术说明表明，Invitrogen Platinum II Taq Hot-Start DNA Polymerase 结合快速循环程序，可在保持高特异性和高产率的前提下，大幅缩短端点 PCR 的总耗时。对于 100 bp–4 kb 目标片段，扩增时间可控制在约 21–38 分钟范围内，同时兼顾了通用退火温度、多模板共循环与后续 E-Gel 快速电泳分析等优势。

 

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