cDNA 合成，用于下游 qPCR

将反转录与实时定量 PCR 相结合，或称为 RT-qPCR，是常见的 RNA 分析方法之一。可用于 RNA 的检测和定量，以进行基因表达分析、病原体检测、疾病研究和其他应用。在 RT-qPCR 实验流程中，有两种常用方法：一步法 RT-qPCR 或两步法 RT-qPCR。

在两步法 RT-qPCR 实验流程中，RNA 的定量需要通过两次单独的反应来完成。首先，在反转录步骤中将样本 RNA 转化为互补 DNA（简称 cDNA）；获得的第一链 cDNA 之后通过 qPCR 进行扩增和定量。两步法实验方案的主要优势包括反应体系配制的高灵活性，以及可以实现一个 RNA 样本分析多个靶标。

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由于基因表达定量的准确度在很大程度上取决于 cDNA 的质量和数量，因此反转录步骤对于 RT-qPCR 的成功至关重要。Invitrogen SuperScript IV VILO 预混液是专为两步法 RT-qPCR 而设计的第一链 cDNA 合成预混液。该预混液含有性能经验证的 Invitrogen SuperScript IV 反转录酶，采用 VILO (Variable Input, Linear Output) 技术，并且优化了缓冲液体系，可在较宽的 RNA 起始量范围内提供出色的性能和线性度。

此外，SuperScript IV VILO 预混液提供 3 重对照，可确保 RT-qPCR 反应的数据准确性和可重复性：

• SuperScript IV VILO 预混液的预混液配方中包含所有反应组分。只需加入 RNA 模板和无核酸酶水，即可完成反应混合物的配制。
• 试剂盒中包含无反转录酶对照，可用于监测 gDNA 污染并避免误导性结果。
• SuperScript IV VILO 预混液（含 ezDNase 酶）可去除 gDNA 污染，同时保持 RNA 的高质量和 RT-qPCR 数据的准确性。

SuperScript IV VILO 预混液因其高可靠性、高效率、高稳健性、易于去除 gDNA 和简化的实验流程而闻名。单击以下属性查看相关支持数据。

超可靠	超高效	超稳健	超安全	超简单
十个数量级 RNA 起始量范围内的高线性度	四倍以上 cDNA 得率，Ct 值低两个循环	对于降解 RNA 样本或含抑制剂的 RNA 样本仍可获得高 cDNA 得率	快速、简单、无损 RNA 的 gDNA 去除	节省时间，简化的实验流程

SuperScript IV VILO 预混液含有一种专有的辅助蛋白，可增强 SuperScript IV 反转录酶与模板 RNA 之间的相互作用，从而将线性度扩展至十个数量级的 RNA 起始量（图1）。较高的线性度有助于确保 cDNA 可代表相应的靶标 RNA 水平，无论其丰度如何。通过将低丰度基因表达量归一化为参考基因表达量，无需担心不同 RNA 起始量水平下反转录效率的潜在差异，有助于提高 RT-qPCR 的准确性。

图1.一系列 RNA 起始量在10个数量级范围内的线性度。将Hela细胞总RNA连续梯度稀释，使用 SuperScript IV VILO 预混液进行 cDNA 合成，然后使用人类 TaqMan Assay for 18S rRNA 和 Invitrogen EXPRESS qPCR SuperMix Universal 进行 qPCR 反应。即使在较宽的 RNA 起始量范围（从 1 fg 到 1 μg）内，预混液相关系数仍达到0.999，效率高达 94.2%。扩增曲线图表明了 SuperScript IV VILO 预混液在较宽 RNA 起始量范围内的稳健性能。这意味着您可以将丰度较低的基因归一化为参考基因，无需担心不同 RNA 起始量水平下 RT 效率的潜在变化。

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从低 RNA 起始量获得的 cDNA 表明，相比其他 8 种 cDNA 合成试剂盒，SuperScript IV VILO 预混液具有更高的效率，cDNA 得率更高且 Ct 值更低（图2）。使用 SuperScript IV VILO 预混液时，cDNA 的平均得率可高达 4 倍，Ct 值平均早 2 个循环。cDNA 合成效率更高具有以下好处：

• 您可在 RT-qPCR 实验流程中使用更低的 RNA 起始量
• 对于低拷贝靶标或降解 RNA 也能表现出更高的 RT-qPCR 灵敏度
• 可以将 cDNA 存储以供未来研究

图2.针对一系列不同靶标，均表现出更高的 cDNA 合成效率。针对 1 ng HeLa 细胞总 RNA ，使用不同 cDNA 合成预混液按照各生产商的说明进行 cDNA 合成。使用 Invitrogen EXPRESS qPCR SuperMix 和针对指定基因靶标的 Applied Biosystems TaqMan 引物/探针进行 qPCR。Delta C_t 值 (∆C_t= C_t – C_{tSuperScript IV VILO}) 表明，与其他 cDNA 合成试剂盒相比，SuperScript IV VILO 预混液可获得更高的 cDNA 得率，C_t 值平均低两个循环。

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用于 qPCR 的 cDNA 合成通常需要高质量的完整 RNA 样本，以便获得准确的 RT-qPCR 结果。但是，即使在应对含有常见反应抑制剂（图 3A）或降解 RNA（图 3B）的困难样本时，SuperScript IV VILO 预混液也可提供出色的性能。

图 3A.处理含抑制剂 RNA 样本时具有出色的性能。在含有不同抑制剂的反应中，使用 100 ng HeLa 进行 cDNA 合成。使用 EXPRESS qPCR SuperMix 和针对 B2M 基因靶标的 TaqMan 引物/探针进行 qPCR。Delta C_t 值 (∆C_t= C_t – C_{tSuperScript IV VILO}) 表明，在存在所有受试反应抑制剂的情况下，SuperScript IV VILO 预混液可提供更高的 cDNA 得率和更低的 C_t 值。

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RNA 纯化方法并非万无一失，通常无法完全去除 gDNA。污染性 gDNA 的扩增会导致 Ct 值发生变化，尤其是在检测低表达基因时。DNase I 通常用于去除 RNA 中的 gDNA。但是，DNase I 可能会降解单链 DNA，如引物和 cDNA，因此必须在 cDNA 合成前灭活或去除 DNase I。使用 EDTA 或其他方法去除 DNase I 的过程会损坏或降低 RNA 的得率（图 4A）。

使用含 ezDNase 酶的 SuperScript IV VILO 预混液，可简化 gDNA 去除步骤。Invitrogen ezDNase 酶表现出双链 DNA 特异性活性，可在 37°C 下两分钟内去除 gDNA。ezDNase 酶不耐热，在 50°C 下即可失活，这是 SuperScript IV 反转录酶一般的 cDNA 合成温度。ezDNase 的这一特性省略了单独灭活步骤，可确保 RT-qPCR 结果的准确性和可靠度（图 4A 和 4B）。

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由于 SuperScript IV VILO 预混液中的 SuperScript IV 反转录酶具有高持续合成能力，与传统反转录酶反应速度（60分钟）相比，cDNA 合成反应速度明显更快（10分钟）。此外，使用 ezDNase 去除 gDNA 只需两分钟，且无需单独的酶失活步骤。因此，对于包含 gDNA 去除的 cDNA 合成实验流程，使用 SuperScript IV VILO 预混液所花费的时间比使用传统 cDNA 合成试剂盒所花费的时间短得多（图5）。

图5.实验流程比较。SuperScript IV VILO 预混液 cDNA 合成流程（包含使用 ezDNase 酶处理样本）（上）与使用 DNase I 的传统 cDNA 合成流程（下）对比。

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•  SuperScript IV VILO 预混液手册

•  白皮书：SuperScript IV VILO 预混液，助力获得出色的 RT-qPCR 结果
•  应用指南：对全血 RNA 样本进行可靠、灵敏的 RT-qPCR 分析

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