赛默飞高效引物和探针解决方案能优化PCR/qPCR实验简并碱基设计

订购高品质引物和探针

在现代分子生物学研究中，PCR（聚合酶链式反应）及其变种qPCR（定量聚合酶链式反应）和dPCR（数字聚合酶链式反应）已成为不可或缺的技术工具。然而，实验结果的可靠性和准确性在很大程度上取决于引物和探针的设计与选择。赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific)为您提供一系列高效、精确的引物和探针解决方案，助力您的科研工作。

简并引物

简并引物是在分子生物学中用于扩增同源基因的特殊引物设计策略，是指用来编码一段短肽序列的不同碱基序列的混合物，是一种特殊设计的引物混合物。简并引物旨在与氨基酸序列匹配。简并引物是根据相关和已测序基因同源物的序列数据设计的。这种方法适用于在缺乏基因组信息的情况下，识别基因家族的新成员或来自不同生物体的直系同源基因。引物的简并度是指其包含的独特序列组合的数量。

简并引物设计的常见程序如下：

1）利用NCBI搜索不同物种中同一目的基因的蛋白或cDNA编码的氨基酸序列。

由于密码子具有简并性，不同的核酸序列可能表达的氨基酸序列是相同的，所以氨基酸序列才是真正保守的。首先利用NCBI的Entrez检索系统，查找到一条相关序列即可。随后利用这一序列使用BLASTp(通过蛋白查蛋白)，在数据库中中查找与之相似的氨基酸序列。

2）对所找到的序列进行多序列比对。

将搜索到的同一基因的不同氨基酸序列进行多序列比对，最好采用局部比对程序如BLOCK，也可选工具Clustal W，也可在线分析。

3）确定合适的保守区域。

设计简并引物至少需要上下游各有一个保守区域，且两个保守区域相距50~400个氨基酸为宜，使得PCR产物在150~1200bp之间，最重要的是每一个保守区域至少有6个氨基酸，因为每条引物至少18bp左右。在设计简并引物时，您需要避免6倍折叠位点（L、S和R），并最大化该区域内1倍或2倍折叠位点的数量。

若比对结果保守性不是很强很可能找不到6个氨基酸的保守区域，这时可以根据物种的亲缘关系，选择亲缘相近的物种进行二次比对，若保守性仍达不到要求，则需进行三次比对。总之，究竟要选多少序列来比对，要根据前一次比对的结果反复调整。最终目的就是至少有两个6个氨基酸且两者间距离合适的保守区域。

4）利用软件设计引物。

当得到保守区域后，就可以利用专业的软件来设计引物了，如利用pp5进行简并引物的设计。将参与多序列比对的序列中的任一条导入pp5中，再将其翻译成核苷酸序列，有密码子简并性，其结果是有n多条彼此只相差一个核苷酸的序列群，该群可用一条有简并性的核苷酸链来表示(其中R=A/G，Y=C/T，M=A/C，K=G/T，S=C/G，W=A/T，H=A/C/T，B=C/G/T，V=A/C/G，D=A/G/T，N=A/C/G/T)，该具有简并性的核苷酸链必然包含上一步中找到的氨基酸保守区域的对应部分，在pp5中修改参数，令其在两个距离合适的保守的nt区域内寻找引物对，总之要保证上下游引物都落在该简并链的保守区域内，结果会有数对，分数越高越好。

5）对引物的修饰。

若得到的引物为：5-NAGSGNGCDTTANCABK-3，则其简并度=4×2×4×3×4×3×2=2304，很明显该条引物的简并度太高不利于PCR。我们可以通过用次黄嘌呤代替N(因为次黄嘌呤能很好的和4种碱基配对)和根据物种密码子偏好这两种方法来降低简并度。

注意：该方法设计出来简并引物对，适用于用于比对的氨基酸序列所属物种及与这些物种分类地位相同的其他物种。

引物中符号说明：

  • A代表A
  • C 代表C
  • G代表 G
  • T 代表T
  • M 代表A or C
  • R 代表A or G
  • W代表 A or T
  • S代表 C or G
  • Y代表 C or T
  • K代表 G or T
  • V 代表A or C or G
  • H 代表A or C or T
  • D代表 A or G or T
  • B 代表C or G or T
  • N代表 G or A or T or C

由于引物的简并性的问题，所设计的引物通常简并性过高，导致有效引物利用率降低，PCR产物非特异性增高。虽然减少简并引物长度可以相对减少简并性，但随之而来的问题是引物的Tm值过低，有时不得不设计第二对引物对PCR产物进行二次扩增，即巢式PCR，或者需要与Touchdown PCR相结合使用。

赛默飞简并引物相关产品和技术解决方案

赛默飞提供多种类型的引物和探针产品，包括不同简并碱基的引物合成等，以满足不同科研需求。

Invitrogen提供定制化的生物学服务，包括引物、探针和基因合成。我们的专家团队将根据您的具体需求，设计并合成最优质的产品。

产品手册：Invitrogen合成生物学服务产品手册

简并引物产品特点和优势

赛默飞提供的引物和探针产品具有以下显著优势：

  • 高特异性：采用先进设计算法，确保仅扩增目标序列。
  • 高灵敏度：优化序列，提高检测限。
  • 高重复性：严格质量控制，保证批次间一致性。
  • 便捷服务：在线订购平台，快速响应客户需求。

简并引物应用案例和成功故事

某知名研究机构在使用赛默飞简并碱基引物进行qPCR实验时，通过优化后的产品提高了检测灵敏度，并显著减少了非特异性扩增。这不仅节省了大量时间，还提高了数据的可靠性，为其后续研究奠定了坚实基础。

通过选择赛默飞世尔科技提供的高效引物和探针解决方案，您可以显著提升科研工作的效率与准确性。立即联系我们了解更多产品信息并进行订购，让您的科研之路更加顺畅。