内容总结：

介绍基因组编辑原理、修复机制及应用。详细讲解CRISPR-Cas9组成、设计与三种递送形式的差异。重点展示基于Cas9蛋白RNP的高效低脱靶流程、检测试剂盒与设计工具。涵盖体外转录合成gRNA、转染方式选择及不同细胞的效率比较。

演讲者：杨建平博士-——赛默飞资深科学家

类型: 技术讲座

难度: 中级

目标受众: 细胞工程和基因编辑方向的生命科学研究人员

[00:00-09:59] 基因编辑基础流程: 原理介绍及应用和检测方法

[10:00-16:59] CRISPR系统方法: 组成和设计及传递方式

[17:00-24:59] RNP转染方法: 效率比较及脱靶和注意事项

[25:00-32:59] 设计工具使用流程: gRNA设计及引物和模板方法

[33:00-39:59] 合成与转染方法: 产量和稳定性及电转注意事项

学习目标：

  1. 掌握基因组剪切检测试剂盒的操作与判读
  2. 理解CRISPR-Cas9的组成与靶向原理
  3. 学习质粒、mRNA与蛋白RNP三种递送方式的优缺点
  4. 掌握在线设计工具进行gRNA与引物设计
  5. 理解体外转录模板组装、转录与纯化流程
  6. 学习针对不同细胞选择脂质转染或电穿孔的条件优化

基础概念：

  1. 基因组剪切检测试剂盒: PCR产物退火成杂合体并用特异性酶切割不匹配，以胶上比较切割比例评估编辑效率。
  2. CRISPR-Cas9: 由gRNA和Cas9蛋白组成的核酸酶体系，按碱基配对识别并切割靶DNA序列。
  3. RNP复合体: 体外预组装的Cas9蛋白与gRNA复合物，直接转染以触发靶向双链断裂。
  4. NHEJ与HDR: DNA双链断裂后的两种修复机制，分别导致插入/缺失或精确定向修复。
  5. 体外转录gRNA: 通过T7启动子模板快速合成gRNA，包含目标序列与恒定tracrRNA区段。
  6. 脱靶效应: 在非目标位点发生的错误切割，受表达持续时间与序列相似性影响。
  7. 电穿孔与脂质转染: 两种将RNP或核酸递送入细胞的方式，用于不同细胞类型的条件优化。