内容总结：

介绍ThermoFisher最具优势的分子克隆产品及优化方案，协助您更加快速和准确的完成分子克隆流程。我们将讨论包括传统酶切克隆方法，PCR和TOPO克隆及Gateway克隆方法。哪一种最适合您的应用？有哪些注意事项？如何提供克隆效率并缩短操作时间。

演讲者：刘芳 博士 —— 赛默飞应用技术专家

类型: 技术讲座

难度: 中级

目标受众: 分子生物学研究人员、实验技术员、基因工程与合成生物学从业者

[00:00-09:59] 核酸纯化方法: 有机法和柱法流程及注意事项

[10:00-16:59] 反转录与PCR方法: 反转录方法和PCR酶选择及注意事项

[17:00-24:59] 凝胶操作流程: 电泳和快回收方法及注意事项

[25:00-31:59] 酶切和连接操作: 限制酶切和T4连接及端修流程

[32:00-39:59] 克隆与组装方法: TOPO和Gateway方法及无缝组装流程

学习目标：

  1. 掌握核酸纯化的主要方法和纯度判定要点
  2. 理解反转录与PCR中保真与速度的权衡
  3. 学习快速电泳与胶回收的操作流程
  4. 掌握Anza快速酶切与去磷酸化的一体化方法
  5. 理解TA/平端、TOPO与Gateway的克隆策略
  6. 学习无缝组装的重叠序列设计与多片段构建

基础概念：

  1. SuperScript IV反转录酶: 十分钟快速反转录，耐高GC与抑制物，最长可达12.3 kb。
  2. Platinum SuperFi高保真酶: >100倍保真度，热启动，高速延伸，最长扩增约20 kb。
  3. Anza快速限制性内切酶: 单一缓冲液，10–15分钟酶切，兼容修饰酶与去磷酸化。
  4. TOPO克隆: 拓扑异构酶介导末端连接，实现TA/平端/定向快速克隆。
  5. Gateway重组: LR/BP酶在att位点进行特异重组，片段在多载体间快速转换。
  6. 无缝克隆/组装: 基于片段重叠序列的同源组装，实现多片段无缝连接。
  7. 核酸纯化与定量: 有机法、柱法、磁珠及自动化；260/280等纯度比值与荧光定量。