内容总结：

  1. 蛋白抽提的原理和应用
  2. 小量蛋白样品的提取方法选择
  3. 提取后的样品处理方法和原则
  4. 样品制备的常见问题和对策

演讲者：俞志浩 博士——赛默飞蛋白质生物学产品应用专家

类型: 技术讲座

难度: 中级

目标受众: 生命科学研究人员、分子生物学实验人员、蛋白质组学与生物化学实验初学者

[00:00-09:00] 蛋白提取方法: 方法选择及注意事项

[09:00-18:00] 化学方法原理: 原理和流程及效果对比

[18:00-27:00] 细胞器分离操作: 方法和流程及注意事项

[27:00-36:00] 裂解液配方选择: 配方选择和注意事项

[36:00-45:00] 样品评估与定量: 产量和定量方法及判断

[45:00-51:00] 样品净化流程: 去除杂质和浓缩流程

学习目标：

  1. 掌握物理与化学蛋白提取方法的选择原则
  2. 理解洗涤剂结构、CMC概念及其对裂解的影响
  3. 学习顺序化学提取分离细胞器的流程
  4. 掌握RIPA与IP裂解液的应用场景与注意事项
  5. 理解蛋白酶与磷酸酶抑制保护策略及配比
  6. 学习样品质量评估、产量预期与定量方法
  7. 掌握去除盐与洗涤剂的透析与浓缩流程

基础概念：

  1. 临界胶束浓度（CMC）: 洗涤剂由单体转为形成胶束的阈值浓度，影响裂解与溶解行为。
  2. 洗涤剂类别: 非离子型、阴离子型、两性离子型与两性离子型（zwitterionic）洗涤剂的结构与用途。
  3. RIPA裂解液: 含多种去污剂的强力裂解液，可裂解核膜并提取核蛋白但易带入核酸。
  4. IP裂解液: 温和配方以保持蛋白相互作用，去除SDS和脱氧胆酸以提高免疫共沉淀效果。
  5. 密度梯度离心: 利用细胞器密度差，通过梯度离心分离不同细胞器的物理方法。
  6. 顺序化学提取: 用递增强度的洗涤剂依次提取包浆、膜、核、染色质、骨架蛋白。
  7. 蛋白酶抑制剂鸡尾酒: 多种抑制剂混合抑制丝氨酸、半胱氨酸、酸性及金属蛋白酶活性。
  8. 磷酸酶抑制剂混合液: 针对不同磷酸酶的抑制组合，用于保持蛋白磷酸化水平。
  9. 透析与浓缩: 用半透膜置换小分子并浓缩样品，以去除盐、洗涤剂和还原剂。
  10. 顶空沉淀: 加入冷溶剂进行蛋白沉淀并复溶，用于快速去除杂质和浓缩。