内容总结：

讲座系统介绍核酸纯化的地位和发展历史，RNA纯化不同方法介绍，RNA纯化常见问题分析及常用产品介绍以及网络资源分享。

演讲者：赛默飞技术支持专家

类型: 技术讲座

难度: 中级

目标受众: 生命科学研究人员、分子生物学实验人员、临床与诊断实验室技术人员

[00:00-09:59] RNA纯化方法: 有机、柱、磁珠及亲和方法

[10:00-19:59] 方法选择流程: 优缺点对比及应用场景

[20:00-29:59] RNA质量评估流程: 凝胶判断及OD比值排查

[30:00-39:59] microRNA提取方法: 柱法和磁珠及直测方案

[40:00-49:59] 特殊样品提取流程: 血液与FFPE及注意事项

[50:00-51:59] 病毒提取方法和自动化: 离心柱和磁珠及仪器

学习目标：

  1. 掌握有机、硅胶柱、磁珠与亲和纯化的基本流程
  2. 理解各方法优缺点并选择适用的提取方案
  3. 学习样品收集与RNase去除的关键操作
  4. 掌握凝胶与OD比值评估RNA质量的要点
  5. 理解microRNA、血液与FFPE等特殊样品的提取策略
  6. 了解病毒核酸分离与自动化提取的应用

基础概念：

  1. TRIzol: 基于酚/氯仿分层的总RNA提取有机试剂
  2. 硅胶柱法: RNA与硅胶膜结合，洗涤与洗脱获得RNA的柱式方法
  3. 磁珠法（在诺磁珠）: 表面功能化磁珠结合核酸，磁力分离实现纯化
  4. 亲和纯化: 利用特异性配对（如oligo(dT)-polyA）富集目标RNA
  5. RNAlater/RA later S: 样品中快速灭活RNase并稳定RNA的保存溶液
  6. OD260/280与260/230: 评估核酸纯度的吸光度比值指标，反映蛋白与杂质污染
  7. FFPE: 甲醛固定石蜡包埋样品，核酸交联与片段化严重
  8. Tempus采血管: 含RNA稳定试剂的血液采集管，便于后续提取

常规样品的RNA纯化常见问题：

Q1：如何评估 RNA 的质量？

看纯度比值： OD260/OD280、OD260/OD230

OD260 代表核酸吸收；OD280 代表蛋白吸收；OD230 多为其他杂质（如多糖/有机物）。

在10 mM Tris 缓冲液中纯 RNA 的 260/280 ≈ 1.9–2.1；260/230 ≈ 2非常接近 2 为佳

Q2：OD260/OD280 偏低，可能原因与对策？

  1. 溶剂 / pH 影响： 用水溶解会使 260/280 偏低 → 改用合适 pH 的缓冲液溶解。
  2. 蛋白或有机物（如酚类）污染： 抽提分相时易带入 → 取样避开中间相，优先取上清，适当增加洗涤步骤。
  3. 裂解不充分： 细胞/组织未完全破碎 → 补足裂解试剂（如 Trizol）体积并充分匀浆。
  4. 沉淀未充分溶解/过度干燥： → 完全溶解 RNA，避免把沉淀吹得过干。

Q3：OD260/OD230 值偏低，经常小于 1，是什么原因？

  1. RNA 浓度过低，因此即使是很少量的污染物对于比值也有很大影响；
  2. 盐类以及酚类的影响（酚有两个吸收峰：275nm, 220–240nm）；
  3. 多糖的污染。
  4. 建议（以 Trizol 为例）：

 异丙醇沉淀 RNA 时不要放于 -20 度，短时间内室温即可；可增加一步 75% 乙醇 wash 的步骤；在样品充分匀浆后增加离心步骤，去除沉淀后加入有机试剂（可参考 TRIZOL 说明书的第二步说明）。