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本次讨论会由Lab Roots举办，并由Thermo Fisher Scientific赞助，主题为“超越传统：借助先进光谱流式技术，拓展单细胞与群体水平的多维分析”。主讲人分享了在光谱研究中的经验和技巧，强调了优化光谱面板设计和样本准备的重要性，以确保获得高质量生物数据。讨论涵盖了流式细胞术中染料的选择和优化，包括近红外染料、Tandem和Far Red染料的使用，以及荧光激活细胞分类（FACS）中的荧光素和异硫氰酸荧光素的应用。此外，还讨论了光谱混叠、细胞自发光等挑战，以及如何通过光谱成像系统和新流式自动分析仪来应对这些挑战，以提高数据解析度。
演讲者：Heaven Le A. Roberts
职位：赛默飞研发系统设计工程高级科学家
00:00 利用先进光谱解决方案拓展单细胞和群体分析
本次网络研讨会介绍了通过使用先进的光谱技术来扩大单细胞和群体分析的方法，涵盖了从流式细胞术到空间光谱实验的多种应用。分享了优化光谱面板的技巧，包括仪器使用、实验设计和数据分析，旨在帮助研究者更好地利用光谱技术。讨论了Thermo Fisher Scientific的eVOS S1000系统，以及在实际操作中可能遇到的挑战和解决方案，强调了跨学科合作的重要性。
03:00 空间成像与光谱流式分析技术及其应用
介绍了新开发的EVOSS和Zenith Flow自动仪等平台，强调了光谱流式分析和空间成像在生物研究中的应用。重点讨论了面板设计和样本准备的重要性，包括细胞类型识别、荧光重叠最小化、抗原密度配对以及针对自体荧光的策略。同时，强调了精心准备样本和控制对于实现高质量生物数据分析的关键作用。
07:02 流式细胞术面板设计与荧光素优化
讨论了流式细胞术面板设计时，如何通过选择合适的荧光素与抗原表达水平匹配，以减少信号重叠，提高检测效率。特别指出，应将低表达抗原与高亮度荧光素配对，高表达抗原与低亮度荧光素配对，以优化面板性能。同时，强调了样品处理和保存条件对抗原表达水平的影响，建议在设计面板前进行充分的抗原密度测试。
12:01 抗原表达与荧光染料选择对流式细胞术影响
讨论了抗原表达在低丰度细胞群中的重要性，以及如何通过染色和流式分析来识别。强调了在设计光谱面板时选择合适荧光染料的策略，特别是对于低丰度但高表达的细胞群。指出使用亮度不同的荧光染料对数据解析的影响，建议选择亮度较低的染料以减少串扰，提高解混能力。最后，提到了使用软件工具快速评估荧光染料相似性的方法，以及如何合理搭配相似染料以优化实验设计。
17:44 自体荧光在流式细胞术中的影响及处理策略
讨论了自体荧光在流式细胞术中的重要性，指出它不仅是样品处理不当的标志，也反映了活跃的细胞代谢。通过案例分析，强调了自体荧光对特定荧光通道的影响，特别是对颗粒细胞的影响，并提出针对性的自体荧光减除策略以优化数据分析。
23:04 空间生物学中自体荧光减除及样本准备的重要性
讨论了空间生物学领域内自体荧光对信号的影响，提出使用高亮染料和自体荧光减除技术来增强信号与降低噪声。强调样本准备过程，如固定、渗透、缓冲液选择等对实验结果的影响，建议在实验前进行充分的预实验和对照设置，以确保数据的准确性和可重复性。
29:57 流式细胞术中珠粒与细胞对照的优劣比较
讨论了在流式细胞术中使用珠粒作为对照的优势，特别是在处理稀有细胞群体和有限样本时，珠粒对照能够提供更稳定的信号强度，避免了细胞对照可能带来的信号不均一性问题。此外，还介绍了新推出的超光谱珠粒产品，它们特别针对远红外和串联染料进行了优化，适用于大型光谱面板。强调了在解混软件中正确设置对照的重要性，以及如何通过调整对照门控来改善解混结果。最后，提到了空间生物学中的光谱解混应用，建议在设计光谱面板时进行多次试验以确保最佳结果。
34:47 空间生物学中的光谱解混技术
介绍了evo SS平台在光谱解混和空间生物学应用中的优势，展示了如何通过软件工具清晰地解析复杂样本中的细胞结构和信号，强调了空间生物学在研究细胞间相互作用和疾病预后中的独特价值。
40:14 免疫肿瘤学研究中的流式细胞术与样本准备
讨论了在免疫肿瘤学研究中，通过流式细胞术分析组织及亚结构的重要性，特别是声学聚焦技术如何在高速下保持数据分辨率。强调了样本预处理步骤，如过滤，对提升数据质量和减少堵塞风险的关键作用。此外，介绍了软件功能在简化实验设置和数据分析中的便利性，如一键式混合选择和面板创建工具，以适应不同研究需求。
44:32 光谱分析与实验质量控制
对话深入探讨了光谱能量图更新、重叠区域控制、高异质性样本分析等技术细节，强调了样本质量对数据分析的重要性，并介绍了日间质量控制、光谱目标设定及近红外激光在减少自发荧光中的应用，展示了仪器健康监测与服务团队远程诊断能力。
48:57 流式细胞术中荧光染料与细胞、珠子结合的差异及解决策略
讨论了流式细胞术中荧光染料在珠子与细胞上的不同表现，特别是tandem染料的解混问题。建议使用特定的Fc阻断剂如CD16/32，而非BSA或FBS，以减少非特异性结合。同时介绍了新推出的长波长荧光染料及其在NIR区域的应用，以及Aurora染料在信号增强方面的优势。最后，解释了Zenith仪器如何通过每日质量控制检查预设的光谱电压，确保仪器稳定性。
设计光谱流式面板时需要注意哪些关键因素？
设计光谱流式面板需综合考虑目标细胞类型、抗原表达密度、荧光染料光谱重叠、自体荧光水平、对照设置以及生物问题本身。合理匹配抗原与染料亮度，并预留解混容错空间，是构建高维面板的基础。
为什么自体荧光在光谱流式中特别重要？如何处理？
自体荧光会显著增加背景噪声，尤其在肺、肝等组织样本中更为明显，可能掩盖弱阳性信号或导致错误设门。可通过专用自体荧光减除算法（如Thermo Fisher平台支持的功能）进行校正，但需确保选择正确的参考群体，避免过度校正损失真实信号。
EVOSS 1000 是什么？它对空间生物学研究有何意义？
EVOSS 1000 是 Thermo Fisher Scientific 推出的新一代空间成像系统，基于成熟的光谱技术平台，操作简便（“即拍即得”），支持全光谱采集与自动解混，适用于高plex组织样本的空间表型分析，显著降低空间生物学实验门槛。
暗染料和亮染料在光谱面板中各有什么优缺点？
暗染料信号易被噪声淹没，需依赖上游设门富集；但其光谱干扰小，适合构建超大面板。亮染料信号强，但可能产生跨激光线溢漏，尤其在高表达抗原上更明显。合理搭配二者可平衡灵敏度与多色兼容性。
样本制备对光谱流式结果有多大影响？
样本制备直接影响荧光信号强度、细胞活性和自体荧光水平。例如，固定/破膜步骤可能改变抗原表位或增强背景；缓冲液中的BSA或Fc阻断剂可减少非特异性结合。高质量的样本是获得可靠数据的前提，远胜于后期数据清洗。
如何准确识别稀有细胞群的抗原表达水平？
稀有细胞群即使抗原表达密度高，也可能因数量少而被误判为“低表达”。建议先通过上游设门富集目标群体，再评估其荧光强度。切勿仅凭整体分布直方图下结论。
为什么不能只看分离指数（Separation Index）来评估流式质量？
分离指数仅反映两个群体间的相对距离，无法体现信号绝对强度或光谱重叠的真实影响。两个群体可能分离良好但信号微弱，或光谱高度相似导致解混误差——因此需结合全光谱视图和质控工具综合判断。
光谱相似性矩阵（Spectral Similarity Matrix）有什么用？
该工具可实时计算所有荧光染料间的光谱相似度，快速识别高风险组合（如BUV651与BV496在肺组织中的干扰），帮助优化面板设计，避免后期解混失败。