WesternBlot常见问题和解决方案

内容总结：

1. Western Blot技术原理与流程；
2. Western Blot常见问题和解决方案；
3. 典型Western blot结果分析。

演讲者：朱长红 博士 -- 赛默飞蛋白质生物学产品应用专家

类型: 技术讲座

难度: 中级

目标受众: 生命科学研究人员、分子生物学实验人员、研究生及实验室技术人员

[00:00-09:59] 样品制备流程: 裂解方法和抑制剂及注意事项

[10:00-19:59] 电泳分离方法: 体系选择和凝胶浓度及注意事项

[20:00-29:59] 手灌胶与预制胶: 问题与解决和选择流程

[30:00-39:59] 转膜操作方法: 膜选择和湿转干转及注意事项

[40:00-49:59] 封闭与抗体流程: 封闭液和抗体筛选及注意事项

[50:00-60:00] 显影与排查操作: 底物选择和故障排查及优化

学习目标：

1. 掌握Western Blot的三步核心流程及关键节点
2. 理解裂解方法、抑制剂与小分子去除的要点
3. 学习SDS-PAGE与不同体系凝胶的选择原则
4. 掌握转膜方式与膜类型选择及参数优化
5. 理解封闭体系兼容性与抗体浓度优化方法
6. 学习化学发光底物与成像系统的选择与验证
7. 掌握无信号与高背景的排查思路与解决方案
8. 学习抗体剥离与胶片背景去除的实操流程

基础概念：

1. 蛋白酶抑制剂: 裂解中加入以抑制蛋白酶，防止样品降解。
2. 磷酸酶抑制剂: 稳定蛋白磷酸化修饰，防止去磷酸化。
3. SDS-PAGE变性还原: 加入SDS和还原剂按分子大小分离蛋白的电泳方法。
4. Tris-甘氨酸体系: 经典碱性电泳与Laemmli样品缓冲，pH变化可能诱发剪切。
5. Bis-Tris中性体系: 中性pH以MES/MOPS为跑胶缓冲，LDS样品缓冲，分辨率更佳。
6. PVDF与硝酸纤维素膜: 两种转膜载体，韧性与背景不同，需按蛋白大小选孔径。
7. 预染与未预染Marker: 预染用于监控迁移，未预染更准需染色；ECL可视Marker可同步显影。
8. 半干转与干转: 短时低缓冲液转膜方式，与湿转效果相当或更佳。
9. 化学发光底物(HRT): HRT底物用于ECL检测，需按灵敏度与持久度选择。
10. 抗体剥离: 用剥离液移除膜上抗体以进行重复检测。