内容总结：

讲座系统梳理Western blot四步流程，并引入iWestern加速方案。涵盖SDS-PAGE原理、预制胶与梯度胶选择、湿转/干转/半干转及膜选择。详细说明封闭与抗体选择、化学发光与荧光检测，以及成像与抗体剥离工具。

演讲者：杨娇 博士赛默飞技术支持专家

类型: 技术讲座

难度: 中级

目标受众: 生命科学研究人员、分子生物学与生物化学实验人员、研究生

  • Western流程介绍: 概念和四步流程及注意事项
  • 电泳方法与原理: SDS-PAGE原理和样品制备
  • 凝胶选择与上样操作: 预制胶选择和上样注意事项
  • 转印流程与膜选择: 湿转方法和膜类型及注意事项
  • 设备操作与染色方法: 干转与半干转和快速染色流程
  • 封闭检测与成像流程: 封闭与检测方法和成像工具

学习目标：

  1. 掌握SDS-PAGE原理及凝胶与梯度胶的选择方法
  2. 理解湿转、半干转与干转流程及膜选择注意事项
  3. 学习封闭策略与洗涤优化以降低背景
  4. 掌握一抗验证与二抗稀释优化及高交叉吸附选择
  5. 理解化学发光与荧光检测的应用与底物选择
  6. 掌握iBlot 2、Power Blotter、iBind与iBright的使用流程

基础概念：

  1. SDS-PAGE: 用SDS使蛋白线性化并统一带负电，按分子量分离的凝胶电泳方法。
  2. Base Tris预制胶: pH约7的中性体系预制胶，条带锐利、运行快、保存稳定。
  3. 湿转/半干转/干转: 将蛋白由胶转移到膜的三种方法，耗时与耗材需求不同。
  4. PVDF与NC膜: 两类转印膜，结合力与背景不同，孔径需按分子量选择。
  5. 封闭与洗涤: 占据非特异位点并降低背景的步骤，需优化封闭液与洗涤。
  6. 高交叉吸附二抗: 通过吸附去除跨物种交叉反应成分，降低背景提升特异性。
  7. ECL底物选择: 依据蛋白丰度与信号持久度选择如Pico Plus或Femto。
  8. iBind/iBlot 2/Power Blotter/iBright: 复育自动化、干转、快速转印与染色、成像系统组合加速流程。