核酸定量支持 - 问题排查

如果出现这种情况，在“查看标准品”或"查看校准"下查看标准品和样本的原始荧光值。确认样本的荧光值落在标准品的荧光值之间（或稍稍高于最高的标准品）。如果不是，那么样本已经超过了检测的精确范围。Qubit荧光计的屏幕会显示“超出检测范围”。

稀释你的样本，或者使用较小体积的样本，重新检测。此外，如果你使用的是Qubit DNA HS检测试剂盒或Qubit RNA HS检测试剂盒，可以试试Qubit DNA BR检测试剂盒或Qubit RNA BR检测试剂盒，因为它们的灵敏度更低。

如果可能，你可以试试使用较大体积的样本（最多20µL）。此外，如果你使用的是Qubit DNA BR检测试剂盒或Qubit RNA BR检测试剂盒，可以试试Qubit DNA HS检测试剂盒或Qubit RNA HS检测试剂盒，因为它们的灵敏度更高。

最可能的原因是，样本被其它在260nm有吸光值的分子污染了。NanoDrop分光光度计读取这些污染物，但是 Qubit荧光计不会读取这些污染物。要确定样本的准确组成，可以对同一样本进行Qubit dsDNA检测, Qubit RNA HS检测, 和Qubit Protein检测。查看Qubit检测试剂盒产品手册，获取可能影响检测的污染物列表。进一步稀释或纯化样本以降低污染物浓度。将工作溶液和加入其中的样本充分混匀。

请看我们的下列建议：

• 确保孵育2分钟后再读取读数（对于蛋白，孵育时间为15分钟）。
• 如果你将试管留在Qubit 荧光计内并多次读数，那么读数将随着试管在仪器内的升温而降低。如果你需要读取多个读数，请将试管从仪器中取出，放置于试管架上，让它与室温平衡至少30秒，然后再重新读取读数。
• 如果样本是避光保存的，那么你可以在混匀后3小时内读取读数。超过这一时间，读数将不准确。
• 在读取间隔，将标准品和样本试管保存于黑暗避光处。

请参看下列可能性：

• 如果你一直进行UV吸光值测定而你的读数小于预期，那么可能你的样本被其它有260nm吸光值的分子污染了。
• Qubit荧光计显示的最初数值是检测试管内的生物分子（DNA，RNA或蛋白）浓度。要获得样本中的生物分子浓度，请使用结果显示屏上的"计算存储液浓度" 或 "计算样本浓度"功能。
• 查看Qubit检测试剂盒产品手册，获取可能影响检测的污染物列表。
• 读取标准品和样本数值时，确保仪器的盖子完全关闭。
• 确保染料稀释液是新鲜配制（1 µL染料加入到199 µL缓冲液中）。
• 确保正确标记试管。
• 确保试剂盒未过期。
• 确保染料保存于暗处。
• 确保缓冲液和染料保存于室温。保存于4°C的缓冲液要在室温放置数小时使其平衡至室温。
• 检查溶液中是否有气泡。溶液表面有气泡没关系，但是溶液内部或底部的气泡可能影响读值。
• 为减少移液误差，稀释样本并使用较大体积。在操作高浓度或粘性溶液时这一点尤其重要。请参见下图。

从500 µg/mL lambda噬菌体DNA储存液稀释至25, 50, 100, 300, 400, and 500 µg/mL制备2 μL体积的标准品。10 μL体积的标准品来自于2 μL标准品的5倍稀释。20 μL体积的标准品来自于10 μL标准品的2倍稀释。注意使用2 µL最高浓度的lambda DNA标准品时，检测得到的荧光值小于预期。

这里有一些建议：

1. 在“查看标准品”或"查看校准"下查看标准品的原始荧光值（RFU）。确认样本的荧光值落在标准品的荧光值之间（或稍稍高于最高的标准品）。如果不是，那么样本已经超过了检测的精确范围。请参看产品目录中的各个检测试剂盒的置信区间。如果检测样本超过了置信区间，那么检测读数将是2位有效数字而不是3位。 要使样本进入准确测定范围，可稀释样本或使用更多或更少体积的样本（例如，如果样本读值较低的话，使用10 µL而非2 µL）。
   
2. 检查温度因素。检测是温度敏感性的，荧光信号在较高温度时会减弱。样本之间或样本和标准品之间的温度波动可能引发问题。
   确保缓冲液和保存在DMSO内的Qubit试剂处于室温。缓冲液和Qubit试剂应保存于室温，而不是冰箱内。保存于 4°C的缓冲液即使在室温放置2–3小时仍然不能达到室温。
   确保你的样本和工作溶液不能过热（包括刚从离心机取出时）。保留在Qubit仪器内过久或多次读取的样本可能会升温。如果你想对一个试管多次读数，你应该将它从仪器内取出，放置30秒以平衡至室温，然后进行下一次读数。另外，在读数之前，不要将试管握在手中过长时间，因为这会加热样本，使读数变低。
   
3. 确保正确制备Qubit工作溶液（使用试剂盒内的缓冲液1:200稀释）。确保正确制备标准品（10 µL标准品加入到190 µL工作溶液中）。确保试管中加入至少200µL液体（对于标准品和样本均是如此）。
   
4. 确保你使用的试剂和标准品是一年之内的，并且标准品保存方法正确。Qubit试剂存储溶液应尽可能避光保存。
   
5. 确保在Qubit荧光计上选择的程序跟你所用的Qubit检测试剂盒是匹配的。
   
6. 读取标准品和样本数值时，确保仪器的盖子完全关闭。
   
7. 使用推荐的检测管（检测管不能阻挡仪器盖上盖子，并且检测管应当光学透明）。某些类型的检测管可能有较高的自发荧光而影响检测。
   
8. 你在Qubit仪器中输入你所加入到工作溶液中的存储液的微升数了吗？如果输入了，那么Qubit荧光计获得此信息后给出的浓度是你的存储液的浓度。如果没有输入，那么你得到的浓度是检测试管（你放入Qubit荧光计的试管）内的浓度——不是你的存储液浓度。
9. 如果你是将Qubit检测的结果和使用UV吸光值获得的浓度进行比较，并且基于UV吸光值的浓度显著较高，那么可能是因为核酸或蛋白污染。Qubit检测试剂对于DNA, RNA和蛋白的检测特异性比吸光值测定法高得多。

请从我们的网站下载并安装最新版本的Qubit固件。
对于序列号小于1104004846的Qubit 2.0 荧光计，请根据本页的说明使用Windows操作系统升级您的Qubit 2.0荧光计。如果您没有PC，请通过lifescience-CNTS@thermofisher.com联系技术支持以获取更多指导。
点击下列的合适链接以安装需要的固件升级：
Qubit 2.0 固件升级
Qubit 1.0 固件升级 （参见本页右下角）

分光光度计不能区分完整核酸、小片段、降解样本，以及单核苷酸。试剂盒中的染料仅检测长度超过20mer左右的完整核酸链。试剂盒仅识别完整DNA或RNA，而忽略降解样本。

• 样本超出检测范围。请使用较低浓度的样本。
• 查看结果屏幕上的荧光值vs浓度图表，确认样本读值是落在标准品读值之间（参见使用手册第24页）。
• 读取标准品和样本读值时，确保仪器的盖子完全关闭。
• 根据你所使用的Qubit检测试剂盒内的说明制备样本和标准品。
• 确保检测完全在室温下进行。

• 样本超出了检测范围。请使用一个浓度更高的样本或使用较低的稀释度（例如，20 μL加入180 μL而非10 μL加入190 μL）。
• 查看结果屏幕上的荧光值vs浓度图表，确认样本读值是落在标准品读值之间（参见使用手册第24页）。
• 确保正确制备Qubit工作溶液（使用试剂盒内的缓冲液1:200稀释）。
• 确保正确制备标准品（10 µL标准品加入到190 µL工作溶液中）。
• 确保标准品试管和样本试管中加入了200 μL溶液。
• Qubit试剂和工作溶液避光保存。
• 在Qubit 3.0荧光仪上选择和你所使用的Qubit检测试剂相匹配的程序并正确校准荧光计。标准品必须以正确的顺序使用。
• 确保检测完全在室温下进行。

• 样本超出了检测范围。请使用一个浓度较低的样本。
• 查看结果屏幕上的荧光值vs浓度图表，确认样本读值是落在标准品读值之间（参见第18页）。
• 读取标准品和样本数值时，确保仪器的盖子完全关闭。
• 根据你所使用的Qubit检测试剂盒内的说明制备样本和标准品。
• 确保检测完全在室温下进行。

• 样本超出了检测范围。请使用一个浓度更高的样本或使用较低的稀释度（例如，20 μL加入180 μL而非10 μL加入190 μL）。
• 查看结果屏幕上的荧光值vs浓度图表，确认样本读值是落在标准品读值之间（参见第18页）。
• 确保正确制备Qubit工作溶液（使用试剂盒内的缓冲液1:200稀释）。
• 确保正确制备标准品（10 µL标准品加入到190 µL工作溶液中）。
• 确保标准品试管和样本试管中加入了200 μL溶液。
• Qubit试剂和工作溶液避光保存。
• 在Qubit 2.0荧光计上选择和你所使用的Qubit检测试剂相匹配的程序并正确校准荧光计。标准品必须以正确的顺序使用。
• 确保检测完全在室温下进行。

负的荧光值物理上是不可能的。它是由于软件自动扣除背景信号而造成的假象。这意味着你的荧光计检测到背景信号并将其扣除从而牺牲了真实数据。务必做一个仅有缓冲液的对照并评估信号的类型。你可能需要换用另外一块板。