赛默飞世尔科技生物制药全面解决方案 （二）

生物制药是目前制药行业最具潜力、最受关注的领域之一，赛默飞世尔科技一致致力于成为生物制药企业的忠实合作伙伴，为生物制药企业在研发和生产过程的每个阶段提供创新性解决方案，从研发、生产直至 QC。

本期，小编将系统介绍赛默飞世尔科技在单抗药物色谱质谱表征层面的全面解决方案。

第二期：单抗药物色谱质谱表征

法规政策要求：

2015版中国药典（三部）首次收录了“人用重组单克隆抗体制品论”，该总论从单克隆抗体的定义、制造和制品检定等方面，全面阐述了人用重组单克隆抗体制品质量控制方面的相关要求。在2015版药典三部收录的治疗性生物技术药列表中，新增了尼妥珠单抗注射液；对于肽图分析这一评价重组产品蛋白质结构及其生产工艺稳定性的重要方法，随着质谱技术在蛋白质结构分析方面的广泛应用，许多实验室已经具备对生物技术药理化对照品进行全面鉴定的能力，因此本版药典“人用重组DNA技术产品总论”增加了生物技术药对照品的鉴定要求，确保了表达的生物技术药与理论预期相一致。随着我国生物制药企业的技术进步，相关法律法规对分析技术的要求也会不断提高。

具体解决方案：

整体分子量测定是蛋白质药物产品（如单抗）研发与质控中最常进行的分析项目，而LC-ESI-Orbitrap MS（电喷雾离子化-静电场轨道阱质谱）已经成为最常用的测量方法之一。

Orbitrap采用傅里叶变换进行离子质量分析，易于实现基线分离——高质量的原始数据为分析结果提供了保证。如图2所示，在完整单抗分析中，Orbitrap准确度一般为10ppm内（以单抗分子量15万计算，10ppm约相当于1.5Da）。

Orbitrap不仅具有超高灵敏度，还独具可实现离子蓄积的硬件设计，使灵敏度更高。在图3中，来源于Orbitrap的数据清晰地显示出单抗9种不同的糖型组合，主要峰的质量误差均在10ppm之内。

图3 Orbitrap 原始数据去卷积后得到的单抗全分子量分析结果

在蛋白质药物产品的质控要求中，需要对蛋白氨基酸序列进行确证，对相关修饰进行鉴定以及定量——即肽图分析。在这个流程中，Orbitrap质谱以其超高分辨率、高质量精度、高灵敏、高稳定性成为业内推崇的质谱分析平台。除此之外，Thermo Fisher提供的生物制药BioPharma Finder软件平台中包含的肽图分析算法来源于生物制药企业巨头之一Amgen，为目前业内最严谨、专业的数据分析软件。该软件除最基本的肽段序列确认、覆盖率分析、修饰位点鉴定与定量、错配二硫键发现、图谱对比、CID/HCD/ETD碎片解析等功能外，还独具未知修饰发现与氨基酸突变查找功能。软件可智能显示多肽的理论质谱碎片，并用于与实验图谱直观对比，以辅助分析，并可快速提高分析员质谱解析水平。

图6 谱图预测与对比功能

糖基化对蛋白药物的疗效、稳定性及免疫原性具有重要影响。以单克隆抗体为例，常见的N-糖型主要为G0F,G1F,G2F,G1FGlcNAc,G0F-GlcNAc等；如果出现OligoMan,Gal-a-1,3-Gal,NGNA,Xyl-1,2 Fuc-1,3等糖型，则会影响免疫原性或半衰期，需要避免；另一方面，通过细胞工程及分子生物学技术，可以提高A-Fuc,GlcNAc,bisecting,G2F,HyperSialyation(NANA)的含量,以增强ADCC,CDC,Anti-inflammatory 等效能。Thermo Fisher开发了一系列简单、高效的液相色谱-质谱表征方法，涵盖了从糖链结构分析到糖基化位点鉴定再到糖肽解析的完整分析流程（图7）。

以Q Exactive 为代表的静电场轨道阱Orbitrap具有10万以上的超高分辨率和amol级的超高灵敏度，结合高能碎裂(HCD)模式，能获得丰富的碎片信息，并高效分辨和检测寡糖。通过牛胎球蛋白三天线复杂型N-糖链的二级质谱分析（图8A）可以看出，即使是未标记的寡糖链，谱图仍然获得了丰富的高强度碎片信号，特别是B/Y、C/Z等跨环断裂信息，对寡糖链精细结构的解析具有重要作用。实验在牛胎球蛋白中成功解析了29种不同结构的N-糖链（图8B），其中绝大部分为含唾液酸的寡糖链，证明Orbitrap对复杂寡糖链的强大分析能力。

图 7 N- 连接寡糖链、糖基化位点以及糖肽的液质分析方法总览

图 8 牛胎球蛋白 N- 糖链二级谱图质谱解析示例 (A) 与解析结果汇总 (B)

单抗药物利妥昔(Rituximab)经Trypsin酶切后，使用QExactive在线分析，碎裂模式为HCD，并使用Byonic TM 软件解析谱图。图9展示了糖肽EEQYNSTYR的谱图解析结果，谱图中存在着丰富的糖肽碎片离子，并获得超高质量精度的可靠匹配，确定糖链结构为G0F。特别是低分子量端的单糖和寡糖碎片，能够作为诊断离子，进一步确证糖肽解析结果。

二硫键

二硫键对于稳定蛋白质药物的空间结构，保持其活性具有重大的作用。而在蛋白质药物的生产过程中，由于成本控制的需求，往往追求较大的蛋白质表达浓度，而使发生二硫键错配(disulfide scramble)的可能性有所上升。因此，二硫键的连接确证成为蛋白质药物质量表征的必须环节。串联质谱在灵敏度、准确性、操作性等多方面独具优势，已经成为二硫键表征的主流方法。

基于Orbitrap    质量分析器的高分辨质谱平台，可以为生物制药分析提供更加快速、灵敏、准确的二硫键信息。图10展示了某IgG1类型的单抗药物二硫键理论连接情况，该类型的抗体中，主要存在16对二硫键，其中重链内部有8对，轻链内部有4对，轻链和重链链间有2对，重链链间有2对，考虑到单抗结构的对称性，最终，非冗余的二硫键共9对。

得益于Orbitrap高分辨质谱的超高灵敏度、超高质量精度和超高分辨率，仅使用trypsin单一酶解的情况下即可对样品中9对二硫键实现100%鉴定。以重链铰链区两对相近的二硫键HC230-HC230和HC233-HC233为例，两条被二硫键连接的肽段二级碎片信息非常丰富，同时一级母离子的质量偏差仅有1.7ppm，由此可以准确、快速的确定这两对二硫键的连接情况（图11）。

HCP

重组蛋白质药物一般由哺乳动物细胞表达生产，生物制品中残留的宿主细胞蛋白质(HCP)作为外源蛋白质可能在不同程度上引发机体的免疫应答，最终导致过敏反应或其他不良反应，因此必须建立合适的检测HCP的方法监控生物制品的质量。

与传统的ELISA方法相比，液相色谱质谱联用（LC-MS）方法具有开发时间短（只需几周），可特异性地对所有HCP进行确证和定量，对所有杂质蛋白质无偏性检测，且方法动态范围高（可达6个数量级），方法调整快等优点，因此液质联用分析HCP已经成为业内关注的热点。但是，HCP实验面对的是蛋白质种类众多、复杂、样品丰度差异巨大的分析对象，并且需要获得蛋白质定性与定量的完整信息，因此对质谱硬件要求极高。在蛋白质组学研究中，静电场轨道阱(Orbitrap)是业内公认的分辨率高、质量精度准、灵敏度高、动态范围宽的质量分析器，其中QExactive是四极杆和Orbitrap的组合质谱平台，具有异常强大的蛋白质鉴定能力，可用于HCP检测中。

在HCP的质谱分析实例中，Katrin等人使用Orbitrap型质谱监控重组蛋白质药物纯化过程中宿主蛋白质的变化，并在最终药物中鉴定到多种低丰度的宿主蛋白质（表1）,对蛋白质纯化方法的优化具有重要参考意义 [1] 。

总结：

无论是全蛋白分子量测定、肽图分析、修饰定量、二硫键发现、糖基化解析等针对蛋白药物自身结构的表征分析，还是宿主细胞蛋白质(HCP)、杂质蛋白鉴定等复杂背景中的质量研究，都包含了对质谱准确性、分辨率、灵敏度、稳定性的多项挑战，却也正好是Orbitrap强大性能的集中体现。Orbitrap系列质谱也正是基于这样的品质，为其使用者提供了最有力的技术保证，并且液相-质谱联用平台也能够与上下游工艺完美衔接。

参考文献

[1] Identification and Monitoring of Host Cell Proteins by Mass Spectrometry Combined with High Performance Immunochemistry Testing. PLOS ONE 2012; 8(11), 1-11

特此鸣谢撰稿人 — 张晓夕工程师

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