TRIzol™ LS 试剂

我们推荐使用纯氯仿。不需要异戊醇（尽管也可以使用比例为49:1的氯仿：异戊醇）。也可以使用含50 ppm戊烯的氯仿。此外，BCP（1-溴-2-氯丙烷）可取代氯仿。

小体积（0.5-0.8 mL）TRIzol试剂已成功用于10^2 to 10^5个细胞。但是，如果使用小体积，我们推荐使用小离心管，从而尽可能获得较高的水相柱。液体柱越高，样品被中间相污染的可能性就越小。
以下是从少量组织（1–10 mg）或细胞（100–10,000）中分离RNA的实验方案：

1.向样品中加800 μL TRIzol试剂。用移液器反复吹打以混匀细胞。直接向TRIzol试剂中加入200 μg糖原（货号10814010）。处理组织时，首先在液氮中粉碎组织，然后加入含200 μg糖原（终浓度250ug/ml）的800 μL TRIzol试剂，随后用力涡旋振荡或强力匀浆。
2.在室温下，盖上管帽并高速涡旋10秒。确保TRIzol试剂使试管边缘湿润，使所有可能残留在管壁的样品溶解。
3.剪切基因组DNA时，将样品通过连接1 mL注射器的26-gauge针两次。使用注射器将样品转移到灭菌的1.5 mL微量离心管中。
4.向每个样品中加入160 μL氯仿（或比例为49：1的氯仿：异戊醇），涡旋振荡最多30秒。将微量离心管以最大速度离心5分钟，实现液相分离。
5.将上层水相转移到新离心管中，并加入400 μL预冷的异丙醇。将样品置于–20°C沉淀1小时至过夜。将微量离心管在室温以最大速度离心15分钟，使RNA沉淀。
6.倒出上清液。使用200 μL的70%乙醇洗涤沉淀，并再次以最大速度离心10分钟。倒出上清液，在不破坏沉淀的情况下尽量移除上清液。干燥RNA沉淀。
7.使用30–50 μL无RNase的去离子水重新溶解沉淀。如果是RNase含量较高的组织（如肾上腺、胰腺），则使用100%去离子甲酰胺重悬。确保进行涡旋振荡并使用移液器反复吹打，使沉淀完全溶解。保存于–70°C。

使用TRIzol试剂提取RNA时有若干潜在停止点和推荐保存条件：

样品匀浆步骤：匀浆后（加入氯仿前），样品可在–70°C保存至少1年。匀浆后样品在加入氯仿前，可在室温保存数小时。
样品匀浆步骤：如果样品已在TRIzol试剂中有效裂解且试剂已使核酸酶失活，RNA可在室温下安全保存3-4天。
RNA沉淀步骤：异丙醇中的RNA可在4°C保存过夜。在这种低温条件下延长保存时间不会明显影响RNA产量。不要保存在-20°C下，因为盐会沉淀；不要长期保存在室温中，因为异硫氰酸胍会损害RNA。
RNA洗涤步骤：75%乙醇中的RNA在4°C可保存1周，在-20°C可保存1年。

核酸的吸光度取决于介质的离子强度和pH。请查看以下按稀释剂进行分类的吸光值范围。

稀释剂 A260 A280 A260/A280 RNA (µg/mL)
细胞质RNA溶于蒸馏水 0.381 0.223 1.711 15.24
细胞质RNA溶于TE缓冲液 0.335 0.145 2.310 13.4
使用TRIzol试剂分离的RNA溶于蒸馏水 0.585 0.328 1.785 23.4
使用TRIzol试剂分离的RNA溶于TE缓冲液 0.544 0.247 2.206 21.76

尽管高A260/A280比值可能并不代表核酸样品非常纯，但低A260/A280比值（RNA为1.7）确实代表样品存在污染并且可能不适合某些应用。

请访问我们的网站（https://www.thermofisher.cn/cn/en/home/references/ambion-tech-support/rna-isolation/general-articles/tips-for-working-with-blood-samples.html），查看处理血液样品的技巧。