MAX Efficiency™ DH10Bac 感受态细胞

请检验入门克隆的构建，应确保插入片段位于载体读码框内。在LR反应后，利用PCR法分析重组病毒DNA，确认插入片段的大小和方向均正确。对PCR产物进行测序，确认用于表位标签表达的读码框正确。

为得到高滴度储液，应使用P1储液再次感染细胞并生成P2高滴度储液。按照BaculoDirect使用手册第18页的说明，生成P2储液。

请查看以下建议：

•在转染到昆虫细胞中之前，利用PCR分析检验LR反应。
•在转染实验中，我们建议使用无添加的Grace’s昆虫细胞培养基代替无血清培养基，因为无血清培养基中的有些成分可能干扰转染。
•转染期间，应保证无FBS、无添加剂、无抗生素，因为这些物质中的蛋白质会干扰Cellfectin II试剂。
•LR重组反应中，以pENTR/CAT质粒为阳性对照，以Cellfectin II试剂（模拟转染）作为阴性对照。
•确保细胞处于对数生长期，存活率高于95%，细胞使用量应与使用手册的建议一致。
•若转染效率较低，细胞可能需要1周时间才能出现病毒感染迹象；继续培养，同时每日观察细胞的感染迹象。

在37°C水浴中温浴更昔洛韦5-10分钟，然后涡旋数分钟。沉淀应该重新溶解于溶液中。

用于培养昆虫细胞的培养基通常具有酸性pH（6.0-6.5）或含有电子供应基团，可阻止6xHis标签蛋白与Ni-NTA发生结合。昆虫细胞生长培养基所含谷氨酰胺、甘氨酸或组氨酸等氨基酸的浓度显著高于哺乳细胞生长培养基，这些氨基酸可与6xHis标签蛋白竞争Ni-NTA基质上的结合位点。例如，Grace’s培养基（Life Technologies）含有约10 mM谷氨酰胺、10 mM甘氨酸和15 mM组氨酸。

使用含适当成分和pH（8.0）的缓冲液对培养基进行透析，透析用缓冲液与在天然条件下进行纯化所使用的推荐裂解缓冲液相似，通常可恢复最佳的结合条件。应注意，选用的培养基可能导致出现白色沉淀（可能由不溶性盐组成），但6xHis标签蛋白通常留在溶液中。使用无蛋白质的培养基时，可通过蛋白质定量进行检测；或者利用免疫印迹分析法检测6xHis标签蛋白的含量。离心后，可从清澈的上清液中直接纯化6xHis标签蛋白。