Gateway™ LR Clonase™ 酶混合物

•检查反应产物是否被转化进了包含F’episome和ccdA基因的E. coli菌株中（请使用不包含F’ episome的E. coli菌株，例如OmniMAX 2-T1R, TOP10）。
•检查ccdB基因是否有缺失（全部或部分）（在含有50-100 mg/mL氨苄和15-30 µg/mL氯霉素的培液中扩增）。
•检查是否有其它抗性菌株污染。
•检查反应中是否使用了合适用量的DNA。

•质粒由于太大或有毒性而在培养过程中丢失（您可以试一试在30摄氏度下孵育；使用Stbl2 E. coli 以稳定质粒)。
•ccdB基因发生缺失（部分或全部）或点突变（请使用新的目的载体）。
•小克隆可能是与表达克隆共转化的未反应的入门克隆（请降低入门克隆的使用量至每10 µL 反应50 ng；降低用于转化的样本量至1 µL；对于带氨苄抗性标记的目的载体，提高氨苄浓度至300 µg/mL)。

•使用pUC19进行转化以检查感受态细胞是否正常。
•提高铺板使用的菌量。

•延长孵育时间至最长18小时。
•确保转化前使用蛋白酶K处理反应产物。
•检查是否使用了正确的抗生素进行筛选。
•检查att位点序列是否正确。
•检查是否使用了正确的Clonase酶以及它是否功能正常。
•检查是否在反应中使用了推荐量的DNA。
•使用pENTR-Gus质粒进行阳性对照重组。
•如果入门克隆或目标载体太大（>10 kb），那么请将LR反应物孵育过夜，线性处理目标载体或入门克隆，或使用拓扑异构酶I解旋目标载体。

不能，因为N-末端标签的目的载体需要有一个终止子，而终止子的存在将阻断C-末端标签的表达。