Gateway™ pDONR™221 载体

•检查反应产物是否被转化进了包含F'episome和ccdA基因的 E. coli 菌株中（请使用不包含F'episome的 E. coli 菌株，例如DH10B, TOP10）。
•检查ccdB基因是否有缺失（全部或部分）（在含有50-100 mg/mL氨苄和15-30 µg/mL氯霉素的培液中扩增）。
•检查是否有其它抗性菌株污染。
•检查反应中是否使用了合适用量的DNA。

通常，当BP重组后产生大的和小的菌落时，我们建议选择几个大的和小的菌落类型，通过分析限制性内切酶消化结果、基因特异性引物的PCR或测序进行筛选，以确定你拥有什么，并决定最佳的前进方向。如果您分析的菌落中有一个包含您想要的入门克隆，那么您可以将该入门克隆进行LR反应，以生成您想要的表达克隆。

这个问题有几个可能的原因：

•质粒由于太大或有毒性而在培养过程中丢失；为了改善使用棘手的插入片段进行BP反应的结果，下次您可以尝试在30摄氏度下孵育转化后平板和/或使用Stbl2 E. coli来稳定质粒。我们也推荐在做感兴趣的BP克隆反应的同时用pEXP7-Tet质粒进行BP反应阳性对照；对照反应的结果会让你知道大的和小的菌落是否是你感兴趣的插入片段特异的表型。
•ccdB基因发生缺失（部分或全部）或点突变；BP反应阴性对照(不添加BP克隆酶)不应产生任何菌落–如果无BP克隆酶的阴性对照出现菌落，则ccdB/氯霉素表达框受损，我们建议使用新的pDONR载体。
•污染或抗生素过期导致抗生素筛选平板上出现背景菌落 - 如果你做一个无质粒添加的转化阴性对照平板，那么这个平板上不应该产生任何菌落。转化阴性对照平板上的菌落表明有污染或需要制作新的平板了。

•使用pUC19进行转化以检查感受态细胞是否正常。
•提高铺板使用的菌量。

•延长孵育时间至最长18小时。
•确保转化前使用蛋白酶K处理反应产物。
•检查是否使用了正确的抗生素进行筛选。
•检查att位点序列是否正确。
•检查是否使用了正确的Clonase酶以及它是否功能正常。
•检查是否在反应中使用了推荐量的DNA。
•检查引物设计并试一试使用凝胶/PEG纯化attB-PCR产物。
•如果attB-PCR产物或线性attB表达克隆太大（>5 kb），请将BP反应物孵育过夜。

您可以继续，但重组效率将降低大约10倍。