T4 DNA 连接酶 (1 U/μL)

两种酶的主要区别是E. coli DNA连接酶不能连接平末端dsDNA片段。两种酶均可用于修复双链DNA的单链切口以及进行粘末端连接。E. coli DNA连接酶通常被用于在第二链cDNA合成时进行切口修复，因为T4 DNA连接酶可能会导致嵌合插入的形成。

请考虑以下建议：

1.尝试不同的插入片段对载体的摩尔比。使用过量的插入片段通常会获得成功，试试1:1到15:1的插入片段：载体比例。
2.尝试增加连接反应在37摄氏度的孵育时间。
3.尝试在16摄氏度进行连接过夜（你可以在PCR仪上设置这一反应）。

确保对连接酶灭活并将连接反应产物存储在4摄氏度。

您可以设置所有下列对照或者根据面对的问题选择一个您认为最合适的对照：

1.使用环状质粒转化E.coli以评估感受态细胞的转化效率（它们获得DNA的能力如何）。
2.使用去磷酸化的载体进行转化和涂板。这将告诉你去磷酸化是否彻底以及在连接转化涂板后多大比例的克隆可能是假阳性（重新连接的载体或背景）。
3.使用T4 DNA连接酶重新连接酶切后的载体，或者lambda DNA/Hind III标记物。这将帮助你评估连接酶本身是否正常工作。

dATP是一个竞争性抑制剂。磷酸基团将降低连接效率。连接缓冲液中的去垢剂可能不会影响酶活性。高浓度(0.2 M)的Na2+, K+, Cs+, Li+, 和NH4+几乎可以完全抑制酶活性。多胺、精胺和亚精胺也是抑制剂。