T4 DNA 连接酶 (1 U/μL)
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T4 DNA 连接酶 (1 U/μL)

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有 ATP 存在时,T4 DNA 连接酶在双链 DNA 的 3´羟基和 5´磷酸末端之间形成磷酸二酯键。 独特的 T4 DNA 连接酶缓冲液优化了连接过程,5 分钟内即可完成连接 (1)。 单链核酸不是这种酶的底物。 提供 T4 DNA 连接酶技术公告。

应用: 克隆(平末端或粘末端连接)(2)。 向平末端 DNA 添加连接头或接头 (2)。

来源: 纯化自大肠杆菌œ溶素原 NM989。

性能和质量测试: 脱氧核糖核酸内切酶,3´ 和 5´ 脱氧核糖核酸外切酶实验;通过连接效率测试。

单位定义: 一个单位的酶量可以在 37°C 的环境中在 20 分钟内催化 1 nmol 32P-标记焦磷酸通过置换反应进入 ATP。(一个单位等于约 300 粘末端连接单位。)

单位反应条件: 66 mM Tris-HCl (pH 7.6),6.6 mM MgCl2,10 mM DTT,66 μM ATP,3.3 μM 32 P-标记焦磷酸及酶,共 0.1 ml,在 37°C 反应 20分钟。
仅供科研使用。不可用于诊断程序。
规格
兼容缓冲液5X 反应缓冲液
产品类型T4 DNA 连接酶
数量500 U
运输条件干冰
最大浓度1 U/μL
连接酶
Unit SizeEach
内容与储存
T4 DNA 连接酶随附一瓶 5X 反应缓冲液 [250 mM Tris-HCl(pH 值 7.6)、50 mM MgCl2、5 mM ATP、5 mM DTT、25% (w/v) 聚乙二醇-8000]。在 -20°C 条件下储存。

常见问题解答 (FAQ)

T4 DNA连接酶和E. coli DNA连接酶有什么区别?

两种酶的主要区别是E. coli DNA连接酶不能连接平末端dsDNA片段。两种酶均可用于修复双链DNA的单链切口以及进行粘末端连接。E. coli DNA连接酶通常被用于在第二链cDNA合成时进行切口修复,因为T4 DNA连接酶可能会导致嵌合插入的形成。

我如何优化我的连接反应?

请考虑以下建议:

1.尝试不同的插入片段对载体的摩尔比。使用过量的插入片段通常会获得成功,试试1:1到15:1的插入片段:载体比例。
2.尝试增加连接反应在37摄氏度的孵育时间。
3.尝试在16摄氏度进行连接过夜(你可以在PCR仪上设置这一反应)。

我不能立即转化我的细胞。我可以存储我的连接反应产物吗?如果可以,应该存储在什么温度?

确保对连接酶灭活并将连接反应产物存储在4摄氏度。

限制性内切酶克隆需要设置哪些对照?

您可以设置所有下列对照或者根据面对的问题选择一个您认为最合适的对照:

1.使用环状质粒转化E.coli以评估感受态细胞的转化效率(它们获得DNA的能力如何)。
2.使用去磷酸化的载体进行转化和涂板。这将告诉你去磷酸化是否彻底以及在连接转化涂板后多大比例的克隆可能是假阳性(重新连接的载体或背景)。
3.使用T4 DNA连接酶重新连接酶切后的载体,或者lambda DNA/Hind III标记物。这将帮助你评估连接酶本身是否正常工作。

T4 DNA常见的抑制剂有哪些?

dATP是一个竞争性抑制剂。磷酸基团将降低连接效率。连接缓冲液中的去垢剂可能不会影响酶活性。高浓度(0.2 M)的Na2+, K+, Cs+, Li+, 和NH4+几乎可以完全抑制酶活性。多胺、精胺和亚精胺也是抑制剂。