TRIzol™ 试剂

降解的RNA可引起260 nm处的吸光度升高。

沉淀最可能是多糖或细胞膜；DNA应该在中间相。在含血液的样品（如，肝脏）中，可能在沉淀顶部出现可见的红色粘稠层。这最可能是血液产物，不应与上清液一起转移。

•这在皮肤样品中很常见。据推测，皮肤样品中含有脂肪，脂肪微粒在离心时会漂浮。在皮肤样品中，微粒会粘附黑色素，使水相产生颜色。脂肪微粒也可从TRIzol试剂中粘附色素，产生浅粉色。如果认为样品中含有脂肪，则在加入氯仿前对TRIzol试剂处理的匀浆液进行离心。脂肪会在上清液顶层形成透明层；应使用移液器将这一层移走并丢弃。
•若样品含有很多血液，则水相可能会变浑浊和/或淡黄色（可能由于血红蛋白含有铁）。如果离心机不是低温，有机相会变成深栗色；其中一些颜色会进入水相，使水相变为橙色或黄色。
•出现浅粉色水相的原因也可能是样品过度稀释（即，样品与TRIzol试剂的比例> 1:10）或者样品中含有过多的盐和蛋白质。这会引起过早的相分离，可通过在样品中多加入一点TRIzol试剂进行补救。从浅粉色水相中分离的RNA，很可能存在DNA污染。

以下是我们的建议：

1.上游组织获取和组织样品制备——尽可能在手术切除后1小时内固定组织。完成固定步骤前，可能会发生大量RNA降解。最佳固定时长为12-24小时，应使用中性福尔马林或多聚甲醛溶液。在包埋前，固定组织应完全脱水。
2.整块储存——尽可能整块保存，无切割面，以防止暴露于大气中的氧气、水以及光、感染（真菌、昆虫等）等其他环境因素造成持续伤害。
3.RNA分离时组织类型、大小和用量的选择——推荐的组织厚度为10–20 µm。切片数取决于组织类型（影响细胞密度）和表面积（推荐大小：50–300 mm^2）。过多的起始材料可引起滤膜堵塞，产生较差的得率。
4.避免使用过量的石蜡进行组织包埋——尽可能在开始纯化步骤前去除过多的石蜡。对于二甲苯纯化法，室温下2次二甲苯处理应足以完全脱蜡。如果需要，可采取更严格的处理，37–55°C最多孵育30分钟。在二甲苯脱蜡后，一定要完全移去100%乙醇，并在2次100%乙醇洗涤后干燥沉淀。磁珠法利用新型化学反应处理石蜡，将输入量限制到20 µm的切片。

点击 此处（https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/dna-rna-purification-analysis/rna-extraction/rna-sample-extraction/working-with-ffpe-samples.html），阅读关于从FFPE组织中分离RNA的更多信息。

若已知样品具有高含量的蛋白多糖和/或多糖（如大鼠肝脏、大鼠主动脉、植物），对RNA沉淀步骤做如下改进应该可以从分离的RNA中除去上述污染物：

向每1 mL TRIzol试剂匀浆得到的水相中加入0.25 mL异丙醇，随后加入0.25mL高盐沉淀液（0.8M柠檬酸钠和1.2 M NaCl；无需调整pH）。将溶液混合、离心，并继续使用实验方案中的方法分离。
这种改进的沉淀方法可有效沉淀RNA并维持蛋白多糖和多糖的溶解性。为了从多糖含量很高的植物材料中分离纯化RNA，在使用改进沉淀方法的同时，应对初始匀浆液进行额外的离心。通常，在多糖或蛋白多糖污染不会带来问题时，我们不推荐使用高盐沉淀法，因为这个额外步骤并不会带来任何显著优势。一般来说，在多糖或蛋白多糖污染不会带来问题的情况下纯化RNA样品时，使用或不使用高盐沉淀液，总RNA得率都一样。RNA谱会有细微变化，体现在tRNA量的轻微降低。高盐沉淀会使样品中的tRNA减少。