大肠杆菌 DNA 连接酶
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<i></i>大肠杆菌 DNA 连接酶
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大肠杆菌 DNA 连接酶

大肠杆菌 DNA 连接酶可在 β-NAD 存在的条件下催化具有 3´ 羟基和 5´ 磷酸内聚末端的双链 DNA了解更多信息
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大肠杆菌 DNA 连接酶可在 β-NAD 存在的条件下催化具有 3´ 羟基和 5´ 磷酸内聚末端的双链 DNA 之间形成磷酸二酯键。单链核酸不是这种酶的底物。

应用:
第二链 cDNA 合成 (1)。无需平末端连接时,可选择 T4 DNA 连接酶 (2)。

来源:
从含有 λ 溶素原 gt4lop-11 lig+ S7 的大肠杆菌 594 (Su-) 纯化得到 (3)。

性能和质量测试:
脱氧核糖核酸内切酶以及3´ 和 5´ 脱氧核糖核酸外切酶测定;经过连接效率测试。

单位定义:
一个单位是指在含有 0.12 μM (300 µg/ml) 5´ 末端浓度的 20 µl 最终体积中,在 16°C 下于 30 分钟内完成 Hind III-酶切 λ DNA 50% 连接所需的酶量。

单位反应条件:
18.8 mM Tris-HCl(pH 值 8.3)、90.6 mM KCl、4.6 mM MgCl2、3.8 mM DTT、0.15 mM λ-NAD、10 mM (NH4)2 SO4,共 20 µl 溶液,在 16°C 下反应 1 小时。
仅供科研使用。不可用于诊断程序。
规格
兼容缓冲液10X 反应缓冲液
产品类型DNA 连接酶
数量100 U
运输条件经批准可置于湿冰或干冰上运输
连接酶
Unit SizeEach
内容与储存
大肠杆菌 DNA 连接酶随附一瓶10X 反应缓冲液 [188 mM Tris-HCl (pH 8.3), 906 mM KCl, 46 mM MgCl2 , 37.5 mM
DTT, 1.5 mM λ-NAD, 100 mM (NH4 )2 SO4 ]。保存于 -20°C。

常见问题解答 (FAQ)

T4 DNA连接酶和E. coli DNA连接酶有什么区别?

两种酶的主要区别是E. coli DNA连接酶不能连接平末端dsDNA片段。两种酶均可用于修复双链DNA的单链切口以及进行粘末端连接。E. coli DNA连接酶通常被用于在第二链cDNA合成时进行切口修复,因为T4 DNA连接酶可能会导致嵌合插入的形成。

对于大多数连接反应,推荐的插入片段和载体的浓度为多少?

推荐浓度取决于载体和插入片段的大小或插入片段的性质,但对于大多数质粒克隆或亚克隆反应来说,推荐的载体浓度为1-10 ng/µl。插入片段的摩尔浓度通常超过载体的2倍或3倍。

T4和大肠杆菌DNA 连接酶,哪个更好用?

这取决于您的应用。对于含有黏性末端的双链DNA片段之间的连接,两种酶都能使用。大肠杆菌DNA连接酶需要β-NAD存在,而T4 DNA连接酶需要ATP。然而,只有T4 DNA连接酶可以连接平末端DNA片段;大肠杆菌连接酶不可用于这类片段的连接。

大肠杆菌DNA连接酶通常用于第二链cDNA合成中修复缺口。在第二链cDNA合成中,T4 DNA连接酶不可代替大肠杆菌DNA连接酶,因为T4 DNA连接酶对平末端ds cDNA片段连接的功能,可能导致形成嵌合插入。

What is the difference between T4 DNA Ligase and E.coli DNA Ligase?

The main difference between the 2 enzymes is that E. coli DNA Ligase cannot ligate blunt dsDNA fragments. Both ligases can be used to repair single stranded nicks in duplex DNA and to perform cohesive or sticky end ligations. E. coli DNA Ligase is generally used to seal nicks during second strand cDNA synthesis, since T4 DNA Ligase could result in formation of chimeric inserts.

Which T4 DNA Ligase protocol do you recommend when ligating an insert containing one cohesive (sticky) end and one blunt end?

For cloning an insert with one cohesive end and one blunt end, use the conditions for blunt ends.  The sticky end may ligate quickly, but the blunt end ligation will still be inefficient. You should use the more stringent protocol to optimize the blunt end ligation. This usually means using more enzyme (5 U), a lower reaction temperature (14C) and a longer incubation time (16-24 hours).