Pierce™ 未染色蛋白分子量标记物

以下是一些可能的原因和解决方案：

- 凝胶上的分子量标准品的量不足： 将适当体积的分子量标准品上样到凝胶上。以下是我们的建议：
•小型凝胶：每孔5μL（厚度0.75-1.0 mm）或每孔10μL（厚度1.5 mm）
•大凝胶：每孔10μL（厚度0.75-1.0 mm）或每孔20μL（厚度1.5 mm）

- 转印不完全或不理想： 优化转印条件

以下是一些可能的原因和解决方案：

- 样品被煮沸： 丢弃煮沸的等分样品。
- 使用的分子量标准品体积过大： 加入较少的体积或使用前用蛋白质上样缓冲液稀释分子量标准品。
- 储存缓冲液中的DTT氧化： 加入新制备的DTT溶液使最终浓度达到50mM。在95℃下加热10分钟。在室温下冷却并充分混合。储存于-20℃以备将来使用。

•降低电压、电流或缩短转印时间
•确保转膜缓冲液的甲醇浓度合适；可使用浓度为10–20%的甲醇，从而去除SDS-蛋白质复合物中的SDS，并促进蛋白质与膜的结合。
•确保转膜缓冲液的SDS浓度合适（若加入了SDS），SDS浓度不要超过0.02–0.04%。过多的SDS会阻碍蛋白质与膜的结合。过多的SDS会阻碍蛋白质与膜的结合。
•检查膜的孔径和靶标蛋白质的大小。小于10kDa的蛋白质很容易穿过0.45μm孔径的膜。如果您的目标蛋白质小于10 kDa，那么最好使用0.2μm孔径的膜。

•增加电压、电流或转印时间
•凝胶和SDS-蛋白质复合物中的SDS会促进蛋白质从凝胶中洗脱，但抑制蛋白质与膜的结合。这种抑制作用在硝化纤维素膜上的强度大于PVDF膜。对于难以从凝胶中洗脱的蛋白质，如大分子量蛋白质，可在转膜缓冲液中加入少量SDS以改善转印效果。我们建议在组装三明治前将凝胶置于含0.02–0.04% SDS的2x转膜缓冲液（无甲醇）中预平衡10分钟，然后使用含10%甲醇和0.01% SDS的1X转膜缓冲液进行转印。
•甲醇可去除SDS-蛋白质复合物中的SDS，促进蛋白质与膜的结合，但对凝胶本身有一些不良影响，会降低转印效率。甲醇可能导致孔径减小、某些蛋白质发生沉淀以及一些碱性蛋白质带正电荷或变为中性。应确保转膜缓冲液的甲醇浓度不高于10–20%，并使用高质量的分析级甲醇。

预染标准品具有与每种蛋白质共价结合的染料，这将导致标准品在不同的缓冲系统（即不同的凝胶）中迁移率不同。因此，使用预染标准品进行分子量估算将仅得出蛋白质的表观分子量。预染标准品可用于分子量估算、确认凝胶迁移和估算转膜效率，但对于需要精确估算分子量的应用，应使用非预染标准品。