Search
DNA污染的原因有多种: •DNA剪切不完全。 •在杂交步骤后,未完全去除样本裂解液。 •清洗不完全和/或洗涤缓冲液去除不完全。 •样本与磁珠的比例过高。
通过从洗脱液中再次提取mRNA,可以有效清除核糖体RNA。可重复利用初始分离时所使用的相同Dynabeads Oligo(dT)25磁珠。使用洗涤缓冲液B清洗磁珠2次。以4倍体积的裂解/结合缓冲液稀释洗脱mRNA,随后加入磁珠。在室温下孵育并混匀3-5分钟,随后继续执行直接mRNA分离实验方案。
我们推荐立即将Dynabeads磁珠-mRNA复合物或洗脱的mRNA用于RT-PCR的cDNA合成或其他下游应用。如果需要保存,我们推荐使用10 mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)从磁珠上洗脱mRNA并冷冻保存(-80°C)。所有设备和样本都必须是无RNase的。
请查看以下可能原因: •溶液太粘稠。 •蛋白质间相互作用导致磁珠聚集。 尝试以下建议: •延长分离时间(将管子留在磁力架上2-5分钟)。 •向裂解液中加入DNase I(约0.01 mg/mL)。 •将结合和/或清洗缓冲液中的Tween20浓度增加至约0.05%。 •向结合和/或清洗缓冲液中加入最多至20 mM 的β-巯基乙醇。
Dynabeads磁珠可与TaqMan实时PCR反应和非毛细管实时PCR仪器兼容。但是,Dynabeads磁珠具有低水平的自发荧光,在一定程度上会增强PCR反应的荧光信号强度。这可通过在仪器中设置Dynabeads磁珠和水的背景而进行补偿。随后,在所有包含Dynabeads磁珠的实时PCR实验中,可从样本信号强度中减去背景信号强度。或者,在使用标准曲线法分析时,可在用于构建标准曲线的每个样本中均加入适量Dynabeads磁珠。