胺反应性 NHS 酯活化化合物可高效地共价连接到肽氨基末端及肽和蛋白赖氨酸残基的游离氨基端，从而对每份样品中的所有肽进行标记（无论酶切使用何种酶）。由于 TMT 试剂具有相同的结构和质量（即同位素），标记的肽在 LC 分离期间共洗脱并在 MS/MS 分析期间共分离，从而减少样品中肽鉴定的缺失。在 MS/MS 分析期间，还对每个同量异序标签进行片段化，以产生用于样品鉴定和定量的独特报告基因离子质量。通过比较 MS/MS 光谱中两种报告离子的相对强度，完成蛋白定量。