Alexa Fluor™ 488 叠氮化物（Alexa Fluor™ 488 5-甲酰胺-(6-叠氮基己基)，双(三乙铵盐)），5-异构体

•当铜离子在合适的化合价时，点击反应才有效。除了DIBO炔烃-叠氮化物反应外，在缺乏铜离子的条件下，叠氮化物和炔烃不会相互反应。确保在制备之后、二价铜(II)浓度最高时，立即使用点击反应混合物。
•不要使用已经变黄的添加剂缓冲液；其必须无色状态下才有活性。
•为确保TdT酶和点击反应试剂能够到达核内，细胞需要充分地固定和通透。为确保有足量的TdT能进入，组织样品需要用蛋白酶K或其他蛋白水解酶消化。
•部分试剂能结合到铜离子上，并减少其足以催化点击反应的有效浓度。click反应前，不要在任何缓冲液或试剂中引入任何金属螯合剂（例如EDTA、EGTA、柠檬酸盐等）。避免缓冲液和试剂中引入其他可能被氧化或还原的金属离子。进行click反应前，可能需要向细胞或组织样品加入额外的洗涤步骤。
•您可以用新鲜的试剂再次进行点击反应，从而提高信号。将点击反应的时间延长至超过30分钟，并不会提高信号。用新鲜的点击反应试剂再次进行30分钟的孵育，可更有效地提高标记效率。
•自己的细胞可能没有凋亡。准备一份DNase I处理的阳性对照，验证TdT酶反应和点击标记反应是否正确进行。

click反应在叠氮化物和炔烃类间极具选择性。生物体系不可能有其他副反应。任何非特异性背景都是由于染料和多种细胞内组分的非共价连接。Select FX信号增强剂在click反应后减少染料的电荷为基础的非特异性连接方面效果不明显；我们不推荐将其与Click-iT检测试剂一同使用。最佳的减少背景的方法是增加BSA清洗的次数。你应该在同样的过程和检测条件下做无染料或无click反应对照，以证实背景确实是由于染料而不是自发荧光。你同时应该在无TdT酶的对照样品进行完整的click反应来证实click反应信号的特异性。 

click反应中的铜离子使得DNA少量变性（虽然没有BrdU检测所需要的程度），这会影响到包括DAPI和Hoechst染色剂在内的DNA染料的结合亲和力。这种影响只会在传统的EdU试剂盒中出现，而Click-iT Plus EdU试剂盒由于采用的铜离子浓度低，不会出现这种现象。 

•当铜离子在合适的化合价时，点击反应才有效。除了DIBO炔烃-叠氮化物反应外，在缺乏铜离子的条件下，叠氮化物和炔烃不会相互反应。确保在制备之后、二价铜浓度最高时，立即使用点击反应混合物。
•不要使用已经变黄的添加剂缓冲液；其必须无色状态下才有活性。
•细胞需要充分固定和通透，确保click试剂能充分接触到细胞内已掺入click底物的成分。
•部分试剂能结合到铜离子上，并减少其足以催化点击反应的有效浓度。click反应前，不要在任何缓冲液或试剂中引入任何金属螯合剂（例如EDTA、EGTA、柠檬酸盐等）。避免缓冲液和试剂中引入其他可能被氧化或还原的金属离子。进行click反应前，可能需要向细胞或组织样品加入额外的洗涤步骤。
•你可以用新鲜的实验试剂重复click反应尝试提高信号。增加click反应的时间长于30分钟不会提高低的信号。用新鲜的click反应试剂进行第二次30分钟培养在提高标记上更加有效。
•低信号同时也可能是因为EdU、EU和其他click底物的掺入水平较低。如果无法进行充分交联或使用的固定剂有误，其他掺入到细胞组件的click底物（如AHA、HPG、棕榈酸、叠氮化物等）可能会丢失。对于掺入到细胞膜或脂质的click底物，应避免使用乙醇或丙酮固定剂和透化试剂。
•在click反应时，掺入的click底物必须可被接触；相比于变性蛋白，天然蛋白中掺入的氨基酸模拟物的标记水平可能更低。
•你可能需要优化代谢标记条件，包括模拟物孵育时间和浓度。健康的、传代数不高、不太密集的细胞可能更容易掺入模拟物。如果孵育时间达到关注的细胞数目翻倍的时间，则应在多个整倍时间点设置包含额外剂量的click底物的阳性对照。

click反应在叠氮化物和炔烃类间是非常有选择性的。生物体系不可能有其他副反应。任何非特异性本底都是由于染料和多种细胞组件的非共价结合造成的。在click反应后，Select FX信号增强剂在减少染料非特异性电荷连接方面的作用失效；我们不推荐将其与Click-iT检测试剂一同使用。减少本底干扰的最佳方法是增加BSA洗涤的次数。您应始终在同等的处理和检测条件下做无染料或无click反应对照，以证实本底确系染料而非自发荧光所致。此外，您还可在无EdU 或无-EU，仅含溶剂的对照样本上进行完整的click反应，验证click反应信号的特异性。