Gateway™ pENTR™ 3C 双重选择载体

理论上，pDONR载体在BP反应时对插入片段没有大小的限制。我们自己测试过的最大片段是12 kb。TOPO载体对插入片段大小更敏感一些，要获得较高的克隆效率其插入片段长度的上限是3-5 kb。

在得到attB-PCR产物之后，我们建议对产物进行纯化以去除PCR缓冲液，残留的dNTP，attB引物，以及attB引物二聚体。引物和引物二聚体在BP反应中会高效的与供体载体重组，因而会增加转化E. coli时的背景，而残留的PCR缓冲液可能会抑制BP反应。使用酚/氯仿抽提，加醋酸铵和乙醇或异丙醇沉淀的标准PCR产物纯化方案不适合对attB-PCR产物进行纯化，因为这些实验方案通常仅能去除小于100 bp的杂质，而在去除较大的引物二聚体时效果不佳。我们推荐一种PEG纯化方案（请参见使用Clonase II的Gateway技术手册第17页）。如果使用上述实验方案您的attB-PCR产物仍然不够纯，您可以进一步对其进行凝胶纯化。我们推荐使用Purelink Quick 凝胶纯化试剂盒。

请检查您所用的菌株的基因型。我们的Gateway目的载体通常含有一个ccdB基因元件，该元件如果不被破坏，则E. Coli生长将受到抑制。因此，未进行克隆的载体应该在ccdB survival菌株如我们的ccdB Survival 2 T1R感受态细胞中扩增。

目的基因必须两端带有合适的att位点，或者是入门克隆中的attL (100 bp)位点，或者是PCR产物中的 attB (25 bp)位点。对于入门克隆而言，所有位于attL位点之间的部分都将被转移到含有attR位点的Gateway目的载体中，而两端带有attB位点的PCR产物需被转移到一个含有attP位点的供体载体，例如pDONR221。

翻译起始位点的位置，终止子，或者用于表达的融合标签必须在最开始的克隆设计中考虑到。例如，如果您的目的载体包含一个N末端标记而非C末端标记，则该载体应当已经带有合适的翻译起始位点，但是终止子应当被包含在插入片段当中。

小抽（碱裂解）纯化的DNA即适用在Gateway克隆反应中。重要的一点是要将RNA污染去除干净以便得到精确的定量。推荐使用通过我们的S.N.A.P. 核酸纯化试剂盒，ChargeSwitch试剂盒，或PureLink试剂盒纯化的质粒DNA。