TAP 生长培养基，针对衣藻培养进行了优化

请查看以下建议：

1. 为得到最佳结果，藻类细胞浓度应在1 x 106至2 x 106细胞/mL之间（OD范围为0.3-0.5）。细胞浓度不可超过3 x 106细胞/mL。可通过OD750检测细胞生长，线性范围将在0.2-1.2（在1 cm光路中）之间。如果OD值超出线性范围，请稀释并再次检测以获得准确读数。

公式为：细胞数= (OD750 – 0.088)/ 9 × 106 /mL

2. 线性DNA转化比环状DNA转化的效率高很多（有效率约高出70%）。
3. DNA的质量和浓度对于转化效率至关重要。您将需要使用PureLink HQ、PureLink HiPure或相同质量的质粒纯化试剂盒进行DNA纯化。使用小体积的浓缩纯化DNA要比使用大体积的低浓度DNA更好。（如果您在转化线性质粒，则在线性化之后，您将需要在转化前使用凝胶提取或PCR净化试剂盒对质粒进行纯化处理。）我们建议每次电穿孔使用2 µg的线性质粒DNA。
4. 质粒DNA是随机插入到基因组的。通常，只有20%的转化株会明显表达目的基因。我们建议首先通过菌落PCR对菌落进行筛选，确保启动子和目的基因的完全整合，随后通过筛选多个阳性克隆，挑选出表达水平最高的克隆。
5. 由于C. reinhardtii基因组具有非常高的GC含量（约62% GC），如果目的基因适应了高表达C. reinhardtii基因的密码子使用偏好，则重组基因的表达水平会明显改善。
6. 由于转化效率取决于构建体向基因组的随机整合，电穿孔结果将取决于目的基因的性质。您可尝试转化试剂盒中的对照载体，从而确认试剂盒及其电穿孔方法是有效的。

很遗憾，基因沉默是藻类表达中的一个大问题。沉默程度取决于基因序列和从该基因表达到细胞中的蛋白的毒性。pChlamy_4载体专为避免发生常出现于C. reinhardtii的转基因沉默而设计。同时，该载体经过设计，可表达出带有博来霉素/Zeocin抗性基因（sh-ble）的转录融合蛋白。口蹄疫病毒（FMDV）2A肽段的自切序列位于抗生素抗性基因和目的基因之间。该序列可编码一个约20个氨基酸的短序列，介导发生适当切割并产生2个独立蛋白。我们使用该系统得到的阳性转化株，即使在有或无筛选压力下传代多次之后，依然能够维持高表达水平，其持续时间远远长于其他系统。

pChlamy_4载体专为避免发生常出现于C. reinhardtii的转基因沉默而设计。同时，该载体经过设计可表达出带有博来霉素/Zeocin抗性基因（sh-ble）的转录融合蛋白。口蹄疫病毒（FMDV）2A肽段的自切割序列位于抗生素抗性基因和目的基因之间。该序列可编码一个约20个氨基酸的短序列，介导发生适当切割并产生2个独立蛋白。我们使用该系统得到的阳性转化株，即使在有或无筛选压力下传代多次之后，依然能够维持高表达水平，其持续时间远远长于其他系统。

pChlamy_1载体无终止密码子和3' UTR。pChlamy_3载体含有3’UTR，已被证明可增强蛋白表达。

需要。对于TOPO载体，您可通过设计引物，使编码序列与ATG一起位于载体的读码框内。