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Invitrogen GeneArt Precision TALs除了可用于基因删除、基因下调和整合之外,还可以用于基因激活。此外,该系统是基于一个蛋白-DNA系统,而CRISPR是基于一个RNA-DNA系统。TALs效应子可以用于靶向包括哺乳动物、细菌、酵母、植物、昆虫、干细胞以及斑马鱼在内的任何细胞的任何基因。最后,使用TAL系统时脱靶效应更低。请参考下列论文(http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S016816561500200X),文中作者比较了TALEs技术和CRISPR技术。
请看下面的原因和解决方案: - 单链(ss)寡核苷酸设计不正确:确保每个ss寡核苷酸均在3’末端包含用于克隆到GeneArt CRISPR核酸酶载体上的5个核苷酸,比如:正义链3’末端包含GTTTT,反义链3’末端包含CGGTG。 - 双链(ds)寡核苷酸被降解:将5 nM ds寡核苷酸存储于1X寡核苷酸退火缓冲液中,避免反复冻融;将5 nM ds寡核苷酸储存液分装并保存于–20°C。 - 寡核苷酸退火反应效率过低:确保根据实验说明进行退火反应。 - 如果环境温度>25°C,则需要在25°C温箱内进行退火反应。
请看下列建议: •使用高质量的、纯化的质粒DNA进行测序。我们建议使用Invitrogen PureLink HQ Mini质粒纯化试剂盒纯化DNA。向测序反应中加入DMSO至终浓度5%。 •提高用于测序反应的模板量(可提高至通常浓度的两倍)。 •在测序反应中使用7:1摩尔比的dITP:dGTP。
有一些方法可以帮助提高效率,例如,加入抗生素选择和/或使用流式细胞仪分选以富集被转染的细胞都会对提高效率有所帮助。
很不幸,PAM序列对于CRISPR基因编辑是必须的。但是,如果没有PAM序列可用时,您可以使用我们的Invitrogen GeneArt Precision TAL效应因子核酸酶系统。