NorthernMax™ 试剂盒

转膜不完全经常是由于短路引起的。将凝胶的外边缘用Parafilm封口膜封住可以避免这种情况。
大分子量的RNA可能由于分子量太大而转膜不完全。碱性转膜缓冲液如NorthernMax One-Hour转膜缓冲液）可以部分剪切RNA以便大的RNA分子可以更有效的转膜。
您可以在RNA样本中加入溴化乙锭（EB）或在转膜结束后使用EB对凝胶进行染色然后在紫外灯下观察来检查RNA转膜是否完全。RNA分子量标准对于验证大分子RNA的转膜是否完全是非常有用的。我们的Ambion Millennium 分子量标准尤其适合这一目的，因为它们包含从0.5到9kb的间隔1000nt的转录本。

rRNA占总RNA的大约80%。当10 µg总RNA被加入Northern凝胶泳道时， 18S和28S rRNA 条带各包含大约2–6 µg RNA。这些rRNA会和探针非特异性结合，也会和互补序列结合。探针与rRNA的非特异性结合可以通过使用最低量的探针以及仅标记与mRNA互补的序列而减少。使用碱性缓冲液进行转膜可以避免探针非特异性结合。最后，您可以使用较高的杂交和洗涤温度以使探针和rRNA的交叉杂交最小化。

对于针对DNA或RNA目标的RNA探针：将膜放在含有0.1% SDS溶液的瓶内高压灭菌15分钟。如有必要可重复一次。对于仅针对DNA的DNA探针：您可以使用上述用于RNA探针去杂交的实验方案。另一个选择是进行碱变性。将膜在400 mM NaOH内孵育30分钟，然后用 0.1% SDS洗涤15分钟。这些剥离方法可以重复进行2-3次。但是，核酸会逐渐从膜上脱离。

请参考以下10种最能提高您的Northern杂交灵敏度的方法：

1) 提高每条泳道RNA的上样量（最多30 mg）。2）使用poly(A) RNA代替总RNA；10 mg poly(A) RNA相当于大约300-350 mg总RNA（3–5%）。3）换用ULTRAhyb Ultrasensitive杂交缓冲液。4）使用RNA探针而非DNA探针。5）使用下行碱性毛细管转膜法。6）使用最优的杂交温度。7）使用新鲜合成的探针。8）使用高特异性的探针（10^8至10^9 cpm/mg）。9）提高曝光时间（使用放射性探针检测低丰度信号时，曝光可能需要3天左右的时间）。10）根据制造商建议的方法将RNA交联到膜上。

点击此处（https://www.thermofisher.com/cn/zh/home/references/ambion-tech-support/northern-analysis/general-articles/ten-ways-to-increase-the-sensitivity-of-northern-hybridizations.html）查看更多相关的建议。

使用较小的10cm凝胶进行Northern印迹需要30-90分钟，大大快于使用较大的凝胶。但是最大的时间节省步骤在于转膜步骤。传统上，Northern印迹使用毛细管转膜法和高盐缓冲液 (10X SSC或10X SSPE)进行过夜转膜。如果使用一种弱碱作为缓冲液（例如NorthernMax 一小时转膜缓冲液），转膜可在一小时内完成。此外，您可以进行电印迹法，在1小时内完成RNA的转膜。