NorthernMax™ 预杂交/杂交缓冲液

转膜不完全经常是由于短路引起的。将凝胶的外边缘用Parafilm封口膜封住可以避免这种情况。
大分子量的RNA可能由于分子量太大而转膜不完全。碱性转膜缓冲液如NorthernMax One-Hour转膜缓冲液）可以部分剪切RNA以便大的RNA分子可以更有效的转膜。
您可以在RNA样本中加入溴化乙锭（EB）或在转膜结束后使用EB对凝胶进行染色然后在紫外灯下观察来检查RNA转膜是否完全。RNA分子量标准对于验证大分子RNA的转膜是否完全是非常有用的。我们的Ambion Millennium 分子量标准尤其适合这一目的，因为它们包含从0.5到9kb的间隔1000nt的转录本。

下列原因会造成交叉杂交：

•探针浓度过高。
•杂交/洗涤条件不够严格。
•mRNA中有多个探针靶点。
•探针中的非同源序列过多。
•与核糖体条带发生交叉杂交。当总RNA中有大量rRNA时会非特异性结合探针而导致这种情况。在这种情况下，您应该可以观察到特异性条带，但是它可能会很弱。
•杂交温度过低（可以试试提高温度至52°C）。

背景信号有多种类型，而每种类型的产生原因也不同：

1) 遍布印迹膜的斑点状信号：这有可能是因为膜的质量不好，过分干燥或者操作者使用不当（例如，沾到了皮肤上的油脂、手套上的粉末）。请使用新的高质量尼龙膜，操作时使用镊子夹取膜的边缘。斑点状信号还可能是因为杂交试剂的不均匀分布。不要将探针直接加入到浸入杂交溶液的膜上；应先使用杂交溶液稀释探针。
2) 整条泳道出现拖尾：针对特定探针的杂交条件大大低于最优条件将导致泳道特异性的背景和/或严重的交叉杂交。可以在开始时使用较高的杂交温度然后缓慢降温直至得到特异性信号。高探针浓度，尤其是对于非同位素探针，也可能导致泳道特异性背景。请使用10 pM 非同位素标记的DNA探针或者0.1 nM非同位素标记的RNA探针。
3) 遍布印迹膜的斑块：制备探针时掺入不足（或者未掺入的核苷酸没有被移除）会引起膜上的斑块。检查探针质量并移除未掺入的核苷酸。探针制备过程中或杂交缓冲液中的颗粒物（例如当没有完全溶解时）也会造成膜上的斑块。确保这些试剂完全溶解，并且可以考虑使用微型离心机或低速离心机离心，或者使用0.22 µm滤膜过滤以除去颗粒物。

如果你看到和泳道不相关的背景信号，这可能是由于：

•质量差的膜或者不兼容的膜。
•膜在操作过程中过于干燥。
•试剂没有均匀分布。
•微生物污染。
•膜上沉积了颗粒物。
•非同位素检测试剂中有颗粒物。
•膜上有干掉的琼脂糖或转膜缓冲液。
•胶片曝光过程中产生了静电。
•膜在和胶片接触时太湿。

信号弱可能是由于下列原因引起的：

•杂交温度不合适。
•探针降解（放置时间过久）
•探针特异性低（随机引物法应得到大约2 x 10^9 cpm/ug的探针）
•探针未变性（针对DNA探针而言）
•探针浓度太低（<10^6 cpm/mL）
•需要更长的杂交时间。
•RNA转膜效果不好。
•紫外交联不足或过度曝光。
•碱性转膜时间过长（>4 小时）。
•使用了错误的膜（硝酸纤维素）。
•没有按照非同位素检测实验方案。
•信使RNA和核糖体RNA共迁移。
•增强屏使用不正确。

残留RNA可能是由于：

•转膜缓冲液体积不足（>0.5 mL/cm2）
•RNA量过多。
•所用的凝胶太厚（>6 mm）。
•转膜时间不足（我们建议20分钟/毫米）