pENTR™/SD/D-TOPO™ 克隆试剂盒，含 One Shot™ TOP10 化学感受态大肠杆菌
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pENTR™/SD/D-TOPO™ 克隆试剂盒，含 One Shot™ TOP10 化学感受态大肠杆菌

pENTR™/SD/D-TOPO™ 克隆试剂盒利用高效的 5 分钟克隆策略（“TOPO™ 克隆”）将平末端 PCR 产物定向克隆成为进入 Gateway™了解更多信息
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pENTR™/SD/D-TOPO™ 克隆试剂盒利用高效的 5 分钟克隆策略（“TOPO™ 克隆”）将平末端 PCR 产物定向克隆成为进入 Gateway™ 系统或 MultiSite Gateway™ 系统的载体。将平末端 PCR 产物定向克隆 pENTR™/SD/D-TOPO™ 入门载体，效率超过 90%，且包含用于在原核生物中进行表达的上游 Shine-Dalgarno 序列。

该试剂盒包含克隆并选择目标 PCR 扩增基因所需的所有组分：

• Gateway™ 系统就绪 - 在多个载体系统之间快速运送克隆基因
• 快速简便 - 仅需 3 个步骤和短短 ∼5 分钟的实操时间即可完成从 PCR 到 Gateway™ 入门克隆的过程
• 高效 - 通过在正确方向插入正确片段达到超过 90% 的克隆
• 成熟 - 十年可靠性能

pENTR™SD/D-TOPO™ 克隆试剂盒概述

VECTOR：

pENTR™/SD/D-TOPO™ 载体定向克隆载体用于进入 Gateway™ 系统经过优化可进行原核表达

克隆方法

定向 TOPO™ 克隆通过基于拓扑异构酶 I 的 ∼5 分钟定向连接，将平末端校正聚合酶扩增 PCR 产物连接到载体

感受态细胞

两个选项从包含高效率或快速生长感受态细胞的试剂盒中进行选择
轻松进入 Gateway™ 系统
为了进入 Gateway™ 系统，只需通过 PCR 扩增关注的基因并将产物直接添加到提供的拓扑异构酶带电 pENTR™/SD/D-TOPO™ 载体中，孵育 5 分钟并转换提供的感受态大肠杆菌细胞。得到的含有 Gateway™ 入门克隆的 attL 已准备好，可使用您选择的 Gateway™ 目的载体进行高效重组。

优化的 pENTR™ /SD/D-TOPO™ 载体
pENTR™ /SD/D-TOPO™ 载体（图 1）包括 T7 基因 10 翻译增强子和核糖体结合位点 (RBS)，用于在使用原核 Gateway™ 目的载体重组后实现天然蛋白的优化表达您也可使用该载体通过与不同目的载体重组，从而在其他宿主系统中表达。该载体具有位于 PCR 产物插入位点旁侧的 M13 和 T7 引物测序位点和 attL 重组位点。这就可以方便地对克隆进行序列验证并将它们重新组合到含有 Gateway™ 目标载体的各种 attR 中。卡那霉素抗性基因和 pUC 复制区序列用于大肠杆菌中的选择和高拷贝增殖。

简化的定向克隆
借助定向 TOPO™ 克隆技术，无需 PCR 纯化、载体制备或者其他耗费大量时间的 DNA 操作步骤。只需将 PCR 反应产物直接添加至提供的拓扑异构酶带电载体中，孵育 5 分钟，转化并获得高达 90% 的定向插入克隆。具有四个碱基序列的载体对上四个碱基突出端设计为用于 PCR 反应的正向引物，以提供针对拓扑异构酶连接反应的方向性（图 2）。

Gateway™ 重组克隆技术的性能
Gateway™ 重组克隆技术避免限制性酶介导克隆的限制因素，使您能够在仅仅一小时内轻松进入几乎所有表达系统，效率达 99% 且可逆的 Gateway™ 重组反应。由于可以在不同载体之间移动相同的 DNA 序列，无需使用限制性内切酶、连接酶、亚克隆步骤、筛选无数菌落或重新测序，这将有助于您节省时间、金钱和精力。

领先的克隆技术
在克隆方面，TOPO™ 克隆技术和 Gateway™ 重组克隆技术十年来一直是成千上万科学研究人员的可靠伙伴。快速、简单易用且高效的 TOPO™ 克隆和 Gateway™ 重组功能可实现快速克隆和后续在不同分类的 Gateway™ 表达载体之间实现基因转移。

不同试剂盒选择
pENTR™/SD/D-TOPO™ 克隆试剂盒可与 TOP10 感受态细胞一起采购用于标准克隆，或与 Mach1™-T1R 感受态细胞一起采购用于快速生长。
仅供科研使用。不可用于诊断程序。
规格
克隆方法定向 TOPO™
反应次数20 reactions
产品线One Shot
产品类型TOPO 克隆试剂盒
数量20 Reactions
载体pENTR
Unit SizeEach
内容与储存
pENTR™⁄SD⁄D-TOPO™ 克隆试剂盒含有 pENTR⁄SD⁄D-TOPO™ 载体、dNTP、盐溶液、无菌水、通用 M13 测序引物、OneShot™ TOP10 化学感受态大肠杆菌、S.O.C.培养基和 pUC19 对照质粒。将感受态大肠杆菌储存在 -80°C 下。将所有其他组分储存在 -20°C 下。

常见问题解答 (FAQ)

Gateway兼容的TOPO载体同时提供一个对照模板和对照引物。可否提供对照模板的序列吗？

对照模板的序列是受专利保护的。

我正在使用一个定向TOPO克隆载体对我的PCR产物进行克隆。我得到了很多克隆但是它们都带有反向插入的目的片段。我如何才能解决这一问题？

这里有一些可能的原因和建议：

•不正确的PCR引物设计：确保正向PCR引物在5′末端包含CACC序列。CACC序列和定向TOPO载体上的突出序列GTGG互补。
•反向PCR引物和5’末端的GTGG突出序列互补：确保反向引物在5′末端不包含CACC序列。
•使用具有热稳定性的有校对活性的聚合酶，如Accuprime Pfx DNA聚合酶(货号12344024)来获得平末端PCR产物。

对TOPO TA克隆来说最佳的插入片段：载体比例是多少？是否有公式来计算用量？

我们建议起始摩尔比为1:1(插入片段：载体)，范围为0.5：1到2：1(插入片段：载体)。对TOPO克隆来说，2kb大小的 PCR产物的ng值应在5- 10ng之间。

计算公式：< br / > 插入片段长度（bp）/ 载体长度（bp）x 载体用量（ng）= 插入片段：载体比为1：1时所需的插入片段的用量（ng）。

插入片段：载体的最佳比例是多少？是否有公式可以进行计算？

您可能需要尝试不同的插入片段:载体比例，范围从1:1至15:1。

公式：
length of insert (bp)/length of vector (bp) x ng of vector = ng of insert needed for 1:1 insert:vector ratio (插入片段长度 (bp) X 载体重量(ng) ) / 载体长度 (bp) = 插入片段:载体比例为1:1时所需的插入片段重量(ng)

我正在克隆我的目的基因到pENTR/SD/D-TOPO载体中，但我计划在E. coli和哺乳动物细胞中该基因均能表达。这种情况下，Shine-Dalgarno序列会干扰基因在哺乳动物细胞内表达吗？

不会，如果配合合适的哺乳动物DEST载体使用，则Shine-Dalgarno序列不会对基因在哺乳动物细胞内表达产生负面影响。

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引用和文献 (1)

引用和文献
Abstract
Pseudomonas syringae type III secretion system targeting signals and novel effectors studied with a Cya translocation reporter.
Authors:Schechter LM, Roberts KA, Jamir Y, Alfano JR, Collmer A,
Journal:J Bacteriol
PubMed ID:14702323
Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 is a pathogen of tomato and Arabidopsis: The hrp-hrc-encoded type III secretion system (TTSS), which injects bacterial effector proteins (primarily called Hop or Avr proteins) into plant cells, is required for pathogenicity. In addition to being regulated by the HrpL alternative sigma factor, most ... More