Zero Blunt™ PCR 克隆试剂盒
Zero Blunt™ PCR 克隆试剂盒
引用和文献 (18)
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Zero Blunt™ PCR 克隆试剂盒

Zero Blunt™ PCR 克隆试剂盒提供了一种简单的方法，可高效 (>80%) 克隆使用校正读码耐热 DNA 聚合酶扩增的平末端 PCR 产物了解更多信息
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货号 K270020
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Ends: 31-Dec-2025
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Zero Blunt™ PCR 克隆试剂盒提供了一种简单的方法，可高效 (>80%) 克隆使用校正读码耐热 DNA 聚合酶扩增的平末端 PCR 产物。Zero Blunt™ PCR 克隆试剂盒使用多用途 pCR™-Blunt 克隆载体和 ExpressLink™ T4 DNA 连接酶，在五分钟室温连接步骤中生成一个连接产物。

含 pCR™-Blunt 载体的 Zero Blunt™ 克隆™试剂盒的特点：
•快速便捷—5分钟室温连接
• 高效—用于阳性选择的 ccdB 基因可产生 >80% 的具有正确插入片段的克隆
• 灵活—可选择卡那霉素或 Zeocin™ 抗性，实现灵活的抗生素选择

pCR™-Blunt 载体提供：
•位于 PCR 产物插入位点侧翼的 EcoR I 位点，可切除插入片段
• T7 启动子/引物位点，用于体外 RNA 转录和测序
• 用于测序或 PCR 筛选的 M13 正向和反向引物位点

Zero Blunt™ PCR 克隆如何工作
Zero Blunt™ PCR 克隆试剂盒设计用于在非重组的低背景下克隆平末端 PCR 片段（或任何平末端 DNA 片段）。pCR™-Blunt 载体含有与 LacZα 的 C 端融合的致死性大肠杆菌 ccdB 基因（Bernard 等人，1994）。连接平末端 PCR 片段可破坏 lacZα-ccdB 基因融合的表达，从而在转化时仅允许阳性重组体生长。当对转化混合物进行平板接种时，杀死含有非重组载体的细胞。

试剂盒配置
Zero Blunt™ PCR 克隆试剂盒有多种配置可供选择：含 One Shot™ TOPO10 化学感受态大肠杆菌（K2700-20 和 K2700-40）以及不含感受态细胞（K2750-20 和 K2750-40），有 20 次和 40 次反应试剂盒规格。
仅供科研使用。不可用于诊断程序。
规格
细菌或酵母菌株TOP10
克隆方法Blunt PCR
产品线Zero Blunt
产品类型PCR 克隆试剂盒
促进剂T7
数量20 次反应
载体Blunt DNA 克隆载体
产品规格试剂盒
Unit SizeEach
内容与储存
Zero Blunt™ PCR 克隆试剂盒含有线性化 pCR™-Blunt 载体、ExpressLink™ T4 DNA 连接酶、5X ExpressLink™ T4 DNA 连接酶缓冲液、对照模板、dNTP、无菌水以及 M13 正向和反向引物。感受态细胞试剂盒含有 One Shot™ 化学感受态大肠杆菌、S.O.C. 培养基和一种超螺旋对照质粒。

One Shot™ 大肠杆菌在 -80°C 下储存。将所有其他组分储存在 -20°C 下。妥善储存时，所有试剂均可保证稳定储存 6 个月。

常见问题解答 (FAQ)

对TOPO TA克隆来说最佳的插入片段：载体比例是多少？是否有公式来计算用量？

我们建议起始摩尔比为1:1(插入片段：载体)，范围为0.5：1到2：1(插入片段：载体)。对TOPO克隆来说，2kb大小的 PCR产物的ng值应在5- 10ng之间。

计算公式：< br / > 插入片段长度（bp）/ 载体长度（bp）x 载体用量（ng）= 插入片段：载体比为1：1时所需的插入片段的用量（ng）。

插入片段：载体的最佳比例是多少？是否有公式可以进行计算？

您可能需要尝试不同的插入片段:载体比例，范围从1:1至15:1。

公式：
length of insert (bp)/length of vector (bp) x ng of vector = ng of insert needed for 1:1 insert:vector ratio (插入片段长度 (bp) X 载体重量(ng) ) / 载体长度 (bp) = 插入片段:载体比例为1:1时所需的插入片段重量(ng)

当我仅使用载体（无插入片段）进行TOPO反应作为阴性对照时，我得到了很多仅包含载体的克隆。这是否说明我的TOPO载体发生重新连接了？

仅使用载体进行转化不是推荐的阴性对照实验。拓扑异构酶改构过程不是一个效率100%的过程，因此，在您的混合物中将会存在“不含插入片段的载体”，因此会产生克隆。

我正试图将我的磷酸化的PCR产物克隆进一个TOPO载体，而我没有获得任何克隆。但是，当我将同样的产物克隆进一个TA载体时，克隆进行的非常顺利。这是为什么？

磷酸化的产物可以进行TA克隆但不能进行TOPO克隆。这是因为所需的磷酸基团已经包含在载体DNA和拓扑异构酶形成的中间体复合物中。TOPO载体含有一个与拓扑异构酶共价结合的3' 磷酸基团和一个5'磷酸基团。非TOPO载体的线性载体（TA和Blunt）含有一个3' OH基团和一个5'磷酸基团。磷酸化产物在进行TOPO-克隆之前应该用磷酸酶（CIP）处理。

我获得了很多克隆，但是没有一个含有我的目的插入片段。我应该如何解决这一问题？

你可能克隆了一段假阳性序列。TA和TOPO克隆对于存在于某些PCR反应中的小片段（< 100 bp）非常高效。使用硅基DNA纯化系统对插入片段进行凝胶纯化或者电洗脱。确保所有溶液均不含核酸酶（例如避免共用溴化乙锭染色器皿）。

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引用和文献 (18)

引用和文献
Abstract
Utilization of MHC class I transgenic mice for development of minigene DNA vaccinesencoding multiple HLA-restricted CTL epitopes.
Authors:Ishioka GY, Fikes J, Hermanson G, Livingston B, Crimi C, Qin M, del Guercio MF, Oseroff C, Dahlberg C, Alexander J, Chesnut RW, Sette A
Journal:J Immunol
PubMed ID:10201910
'We engineered a multiepitope DNA minigene encoding nine dominant HLA-A2.1- and A11-restricted epitopes from the polymerase, envelope, and core proteins of hepatitis B virus and HIV, together with the PADRE (pan-DR epitope) universal Th cell epitope and an endoplasmic reticulum-translocating signal sequence. Immunization of HLA transgenic mice with this construct ... More
Interactions between protein kinase CK2 and Pin1. Evidence for phosphorylation-dependent interactions.
Authors: Messenger Moira M; Saulnier Ronald B; Gilchrist Andrew D; Diamond Phaedra; Gorbsky Gary J; Litchfield David W;
Journal:J Biol Chem
PubMed ID:11940573
'The peptidyl-prolyl isomerase Pin1 interacts in a phosphorylation-dependent manner with several proteins involved in cell cycle events. In this study, we demonstrate that Pin1 interacts with protein kinase CK2, an enzyme that generally exists in tetrameric complexes composed of two catalytic CK2 alpha and/or CK2 alpha'' subunits together with two ... More
Role of CCAA nucleotide repeats in regulation of hemoglobin and hemoglobin-haptoglobin binding protein genes of haemophilus influenzae.
Authors:Ren Z, Jin H, Whitby PW, Morton DJ, Stull TL
Journal:J Bacteriol
PubMed ID:10482534
'Haemophilus influenzae utilizes hemoglobin and hemoglobin-haptoglobin as heme sources. The H. influenzae hemoglobin- and hemoglobin-haptoglobin binding protein genes, hgpA, hgpB, and hgpC, contain lengths of tetrameric CCAA repeats. Using an hgpA-lacZ translational gene fusion, we demonstrate phase-variable expression of lacZ associated with alteration in the length of the CCAA repeat ... More
Regulation of the Bub2/Bfa1 GAP complex by Cdc5 and cell cycle checkpoints.
Authors: Hu F; Wang Y; Liu D; Li Y; Qin J; Elledge S J;
Journal:Cell
PubMed ID:11733064
'During mitosis, a ras-related GTPase (Tem1) binds GTP and activates a signal transduction pathway to allow mitotic exit. During most of the cell cycle, Tem1 function is antagonized by a GTPase-activating protein complex, Bfa1/Bub2. How the Bfa1/Bub2 complex is regulated is not well understood. We find that Polo/Cdc5 kinase acts ... More
Substantially enhanced cloning efficiency of SAGE (Serial Analysis of Gene Expression) byadding a heating step to the original protocol.
Authors:Kenzelmann M, Muhlemann K
Journal:Nucleic Acids Res
PubMed ID:9889294
'The efficiency of the original SAGE (Serial Analysis of Gene Expression) protocol was limited by a small average size of cloned concatemers. We describe a modification of the technique that overcomes this problem. Ligation of ditags yields concatemers of various sizes. Small concatemers may aggregate and migrate with large ones ... More
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